【摘 要】
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目的观察特定频率和强度的脉冲电磁场(Pulsed Electromagnetic Field, PEMF)对新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞增殖、分化功能和成骨细胞特异性转录因子Osterix (OSX)基因(mRNA)
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目的观察特定频率和强度的脉冲电磁场(Pulsed Electromagnetic Field, PEMF)对新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞增殖、分化功能和成骨细胞特异性转录因子Osterix (OSX)基因(mRNA)表达的影响,探讨PEMF对成骨细胞的直接作用,以期为临床应用PEMF治疗骨质疏松症及相关骨代谢性疾病提供理论基础。方法1.成骨细胞分离、培养与鉴定：成骨细胞分离与培养：取24h内新生SD大鼠,雌雄不限。拉颈处死后,无菌条件下分离大鼠颅盖骨,分别用胰酶-胶原酶消化法和组织块反复贴壁法获取成骨细胞,于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱内进行培养。反复贴壁法进行人工传代纯化。本实验所用成骨细胞均为第4代。成骨细胞鉴定：(1)倒置相差显微镜下观察细胞形态特征、生长状况,并定时进行拍照。(2)碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色法鉴定成骨细胞。2.观察PEMF对成骨细胞增殖功能、分化功能和OSX mRNA表达的影响：取培养至第4代的成骨细胞,胰酶消化后制成细胞悬液,调整细胞浓度,分别以4×104/ml的密度接种到96孔板、以4×104/ml的密度接种到24孔板和以1×105/ml的密度接种到25cm2细胞培养瓶中,培养24h待细胞贴壁后,换入无血清培养液继续培养24h使细胞同步化,再换入新的正常培养基。将细胞分为对照组和脉冲电磁场组(PEMF组),对照组继续正常培养,PEMF组采用频率12 Hz、强度11 mT的PEMF进行干预,60min/(d次),共3d。干预结束后第2d进行如下指标检测：(1)噻唑蓝(MTT)法检测成骨细胞增殖情况；(2)磷酸苯二钠比色法检测成骨细胞裂解液及细胞培养上清液中ALP活力的高低,观察PEMF对成骨细胞分化能力的影响；(3)荧光定量RT-PCR方法检测成骨细胞OSX mRNA表达水平。结果1.成骨细胞的分离、培养与鉴定：采用胰酶-胶原酶消化法和组织块反复贴壁法所得成骨细胞的细胞形态特征和生长状况均符合成骨细胞的特点。经ALP染色后鉴定为成骨细胞。两种方法所得细胞进行纯化后均可得到纯度较高的成骨细胞,用于实验研究。2. PEMF对成骨细胞增殖功能、分化功能和OSX mRNA表达的影响：MTT结果显示,与对照组(0.239±0.116)相比,PEMF组细胞增殖(0.448±0.074)明显增加,且差异具有显著的统计学意义(P<0.01); ALP活力检测结果表明,与对照组(2.552±0.493,0.745±0.372)相比,PEMF组成骨细胞裂解液(0.853±0.276)和细胞培养上清液中(0.620±0.175)ALP的活力值均明显降低,而细胞裂解液的ALP活力降低更明显(分别为P<0.01,P<0.05)；OSX基因表达结果显示,与对照组(1.000±0.072)相比,PEMF组(0.357±0.007)OSX mRNA表达明显下调(P<0.01)。结论频率12 Hz、强度11 mT,60min/(d次),共3d的PEMF干预促进增殖早期成骨细胞增殖功能,抑制成骨细胞分化功能,并下调OSX的基因表达水平。
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