论文部分内容阅读
目的:获取白纹伊蚊ADGF-B(Ab-ADGF-B)活性蛋白,探讨其可能的生物学功能。方法:从NCBI数据库中下载白纹伊蚊Ab-ADGF-B基因ORF序列(GenBank No.AAV90660),对基因序列进行生物信息学分析;将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,将测序正确的重组质粒pET32a(+)Ab-ADGF-B(rAb-ADGF-B)转化入表达菌Rosetta-gamiB(DE3)中,经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并用SDS-PAGE和免疫印迹(western blotting)鉴定。用Ni-NTA亲和层析柱纯化rAb-ADGF-B蛋白后制备抗血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测抗体效价。采用分光光度法检测rAb-ADGF-B蛋白的ADA酶催化活性;同时采用细胞计数法检测rAb-ADGF-B对小鼠巨噬细胞(ANA)的增殖作用;最后检测rAb-ADGF-B对人全血部分凝血酶原时间(prothrombin time,PT),凝血酶时间(thrombin time,TT)及凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)的影响。结果:1.成功构建rAb-ADGF-B重组质粒;测序结果显示:成熟肽基因长1545 bp,编码514个氨基酸;结构域预测显示具有1个ADGF结构域。在20℃、150rpm的条件下经0.4 m M的IPTG诱导24 h获得可溶性rAb-ADGF-B蛋白。获得兔抗rAb-ADGF-B多克隆抗体,效价为1:10000。Western blotting证实获取的重组蛋白是目的蛋白。在30℃,pH 7.0条件下,0.67μM rAb-ADGF-B可以催化100μM腺苷生成肌苷;同时,0.134μM rAb-ADGF-B蛋白和ANA细胞共培养36 h后,细胞数量约由5×104增加到14×105。此外,2.67μM rAb-ADGF-B作用下,PT、TT和APTT分别为13.33S、15.23S、和35S,无延时效应。结论:成功获取白纹伊蚊唾液腺源rAb-ADGF-B可溶性蛋白,该蛋白具有ADA酶活性,对小鼠巨噬细胞增殖有影响。