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背景：
缺血性心脏病是心血管疾病中重要的一种，也是目前严重危害人类健康的一类疾病。由于成人心脏的心肌细胞再生能力十分有限，因此缺血后损失的心肌通常被非收缩性瘢痕组织所替代，而非缺血部位心肌会代偿性收缩，以保证心室正常功能，这部分心肌因负荷加重而出现代偿性肥厚，细胞功能异常及凋亡，最终导致心衰。心脏移植是目前唯一可用的替代病损心肌组织、恢复心功能的临床手段，但心脏移植很大程度上受到供体心脏供应不足以及高昂的治疗费用的限制。因此，以细胞为基础的心脏修复作为改善心脏损伤的一种替代方法应运而生。人多能干细胞（hPSC）具有分化为所有成体细胞类型的潜能，人多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CMs)目前已广泛应用于药物筛选与心肌毒性评估、体外心脏病模型构建及基础研究，同时由于hPSC-CMs作为一种具备相应心肌功能的成熟细胞，可以部分地替换受损心肌，改善心脏功能，因此hPSC-CMs细胞移植治疗在心脏再生医学领域具有极大的应用前景。
由于hPSC-CMs在基础研究、药物筛选等方面的应用日益广泛，尤其是未来的临床治疗应用，使对于多能干细胞来源的心肌细胞的质与量都有着越来越高的要求。为获得足量、足纯的心肌细胞，尽管迄今为止已经建立了多种细胞因子及小分子化合物组合的含血清或无血清诱导方案，也已取得较大进展，然而由于心肌分化的调控机理复杂，尚未完全阐明，使目前体外诱导效率与纯度远未达到临床应用的要求，仍然需要进一步研究阐明心肌分化的调控机制，优化改进诱导方案以提高人多能干细胞的心肌分化效率。
活性氧（ROS）主要来源于线粒体呼吸链和NADPH氧化酶的氧化过程。ROS化学性质活泼，过量产生和积累可导致脂质过氧化，蛋白质氧化和DNA损伤，其与衰老，肿瘤，糖尿病和其他疾病相关。但合适水平的ROS可以作为第二信使参与调控多种生理过程，使细胞发挥正常的生物学功能。本课题在前期研究的基础上，针对活性氧（ROS）在人胚胎干细胞中胚层以及心肌分化过程的作用，通过干预ROS水平观察其对中胚层和心肌分化各方面的影响，并进一步探索优化人胚胎干细胞心肌分化的诱导方案。
目的：
1.观察人胚胎干细胞心肌定向诱导过程中升高及降低ROS水平对于中胚层分化的效率及细胞质量的影响；
2.观察升高及降低ROS水平对于人胚胎干细胞心肌定向诱导分化效率以及最终成熟心肌细胞总数的影响；
3.探索优化人胚胎干细胞心肌定向分化的诱导方案。
方法
1.采用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术以及流式细胞术分别检测人胚胎干细胞心肌定向诱导分化过程中特异性中胚层标记基因Brachury/T的表达变化；
2.测量、计数中胚层分化期间拟胚体的大小、数量以及细胞总数；
3.通过PI染色及AnnexinV染色，采用流式细胞术检测比较细胞凋亡和细胞周期的情况；
4.流式细胞术检测心肌分化末期心肌特异性标记心肌肌钙蛋白T（cardiacTroponinT,cTnT）的阳性率、荧光信号几何均数以及细胞总数，并计算心肌细胞终产量。
结果：
1.升高ROS促进中胚层markerBrachyury/T基因和蛋白水平的表达，增加中胚层分化期间拟胚体的大小及数量，而降低ROS的作用相反。
2.降低ROS促进中胚层细胞的凋亡，而升高ROS对细胞凋亡无影响；干预ROS并不引起中胚层细胞周期的改变。
3.升高ROS提高人胚胎干细胞心肌分化最终自主搏动拟胚体的比例以及cTnT阳性率，降低ROS的作用相反。升高ROS对最终的细胞总数无影响，但降低ROS明显减少细胞总数。
4.中胚层阶段提高ROS水平而心肌分化阶段降低ROS水平能在提高心肌诱导效率的基础上进一步促进细胞存活，提高最终心肌细胞产量。此外，心肌定向分化阶段干预ROS对其最终诱导效率无影响。
结论：
1.ROS对于人胚胎干细胞心肌定向诱导分化早期的中胚层分化是必要的，适度升高ROS水平可促进人胚胎干细胞向中胚层分化；
2.ROS促进人胚胎干细胞心肌分化的主要机制之一是其促进了早期中胚层分化，心肌定向分化阶段干预ROS对其最终分化效率无影响；
3.通过分阶段控制细胞内ROS水平，即在分化早期适度升高ROS水平，并在分化中后期适度降低ROS水平，可进一步提高心肌诱导效率并增加心肌细胞产量。
缺血性心脏病是心血管疾病中重要的一种，也是目前严重危害人类健康的一类疾病。由于成人心脏的心肌细胞再生能力十分有限，因此缺血后损失的心肌通常被非收缩性瘢痕组织所替代，而非缺血部位心肌会代偿性收缩，以保证心室正常功能，这部分心肌因负荷加重而出现代偿性肥厚，细胞功能异常及凋亡，最终导致心衰。心脏移植是目前唯一可用的替代病损心肌组织、恢复心功能的临床手段，但心脏移植很大程度上受到供体心脏供应不足以及高昂的治疗费用的限制。因此，以细胞为基础的心脏修复作为改善心脏损伤的一种替代方法应运而生。人多能干细胞（hPSC）具有分化为所有成体细胞类型的潜能，人多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CMs)目前已广泛应用于药物筛选与心肌毒性评估、体外心脏病模型构建及基础研究，同时由于hPSC-CMs作为一种具备相应心肌功能的成熟细胞，可以部分地替换受损心肌，改善心脏功能，因此hPSC-CMs细胞移植治疗在心脏再生医学领域具有极大的应用前景。
由于hPSC-CMs在基础研究、药物筛选等方面的应用日益广泛，尤其是未来的临床治疗应用，使对于多能干细胞来源的心肌细胞的质与量都有着越来越高的要求。为获得足量、足纯的心肌细胞，尽管迄今为止已经建立了多种细胞因子及小分子化合物组合的含血清或无血清诱导方案，也已取得较大进展，然而由于心肌分化的调控机理复杂，尚未完全阐明，使目前体外诱导效率与纯度远未达到临床应用的要求，仍然需要进一步研究阐明心肌分化的调控机制，优化改进诱导方案以提高人多能干细胞的心肌分化效率。
活性氧（ROS）主要来源于线粒体呼吸链和NADPH氧化酶的氧化过程。ROS化学性质活泼，过量产生和积累可导致脂质过氧化，蛋白质氧化和DNA损伤，其与衰老，肿瘤，糖尿病和其他疾病相关。但合适水平的ROS可以作为第二信使参与调控多种生理过程，使细胞发挥正常的生物学功能。本课题在前期研究的基础上，针对活性氧（ROS）在人胚胎干细胞中胚层以及心肌分化过程的作用，通过干预ROS水平观察其对中胚层和心肌分化各方面的影响，并进一步探索优化人胚胎干细胞心肌分化的诱导方案。
目的：
1.观察人胚胎干细胞心肌定向诱导过程中升高及降低ROS水平对于中胚层分化的效率及细胞质量的影响；
2.观察升高及降低ROS水平对于人胚胎干细胞心肌定向诱导分化效率以及最终成熟心肌细胞总数的影响；
3.探索优化人胚胎干细胞心肌定向分化的诱导方案。
方法
1.采用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹技术以及流式细胞术分别检测人胚胎干细胞心肌定向诱导分化过程中特异性中胚层标记基因Brachury/T的表达变化；
2.测量、计数中胚层分化期间拟胚体的大小、数量以及细胞总数；
3.通过PI染色及AnnexinV染色，采用流式细胞术检测比较细胞凋亡和细胞周期的情况；
4.流式细胞术检测心肌分化末期心肌特异性标记心肌肌钙蛋白T（cardiacTroponinT,cTnT）的阳性率、荧光信号几何均数以及细胞总数，并计算心肌细胞终产量。
结果：
1.升高ROS促进中胚层markerBrachyury/T基因和蛋白水平的表达，增加中胚层分化期间拟胚体的大小及数量，而降低ROS的作用相反。
2.降低ROS促进中胚层细胞的凋亡，而升高ROS对细胞凋亡无影响；干预ROS并不引起中胚层细胞周期的改变。
3.升高ROS提高人胚胎干细胞心肌分化最终自主搏动拟胚体的比例以及cTnT阳性率，降低ROS的作用相反。升高ROS对最终的细胞总数无影响，但降低ROS明显减少细胞总数。
4.中胚层阶段提高ROS水平而心肌分化阶段降低ROS水平能在提高心肌诱导效率的基础上进一步促进细胞存活，提高最终心肌细胞产量。此外，心肌定向分化阶段干预ROS对其最终诱导效率无影响。
结论：
1.ROS对于人胚胎干细胞心肌定向诱导分化早期的中胚层分化是必要的，适度升高ROS水平可促进人胚胎干细胞向中胚层分化；
2.ROS促进人胚胎干细胞心肌分化的主要机制之一是其促进了早期中胚层分化，心肌定向分化阶段干预ROS对其最终分化效率无影响；
3.通过分阶段控制细胞内ROS水平，即在分化早期适度升高ROS水平，并在分化中后期适度降低ROS水平，可进一步提高心肌诱导效率并增加心肌细胞产量。