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研究背景:糖尿病(Diabetes Mellitus)已经在全世界范围内成为危害人类身体健康的一大杀手。糖尿病分为胰岛素依赖的1型和进展较慢、可长期不依赖胰岛素治疗的2型,但无论哪种类型糖尿病最终都会出现β细胞的损伤和凋亡,并最终导致胰岛功能的失代偿,而不得不进入胰岛素依赖期。本课题组前期研究发现,在糖尿病大鼠模型和高糖高脂培养的成鼠心肌细胞中,TXNIP(Trx interacting protein)的表达显著增加,同时心肌细胞的损伤和凋亡也增加,RNA干扰抑制TXNIP表达后,细胞凋亡的发生显著减轻,提示TXNIP的高表达可以促进细胞凋亡。目前TXNIP已经被认为是在β细胞的生理功能和糖尿病的药物治疗上的一个关键分子。研究表明,在2型糖尿病中内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)参与了β细胞的凋亡。由于在ER中大量未折叠的蛋白会激活未折叠蛋白反应,如果这个问题一直存在的话就会导致内质网应激通过PERK(protein kinase RNA(PKR)-like ER kinase)、IRE1α(inositol-requiring protein-1α)、ATF6α(activating transcription factor 6α)3条通路从而促进细胞凋亡。目的:本研究旨在用腺病毒转染技术,诱导INS-1细胞内的TXNIP蛋白高表达,观察过表达的TXNIP本身是否可以引起正常糖脂浓度条件下的INS-1细胞发生细胞凋亡,重点研究内质网应激是否参与了TXNIP诱导的INS-1细胞凋亡的发生,并对内质网应激通路的下游机制进行分析。方法:(1)实验分组和腺病毒转染:将在正常糖脂浓度下培养并处于对数生长期的INS-1细胞分为三组,分别是正常培养(normal)组,空病毒(ad-egfp)组,过表达(ad-txnip-egfp)组,按照感染复数moi=50计算出转染组需要的病毒量,取各组所需的病毒量分别加入到1ml1640培养基中混匀,加入细胞中转染,对照组直接加入1ml1640培养基,4h后补3ml1640完全培养基继续培养;分别于24h,48h换液处理,并于荧光显微镜下观察拍照。(2)观察转染率:通过对同一个视野下带绿色荧光蛋白的细胞所占的比例进行计算,分别计算出ad-egfp组和ad-txnip-egfp组ins-1细胞转染24h、48h的转染率,观察到48h时的细胞存活率和转染效率最高,收集此时的细胞进行后续实验。(3)real-timepcr实时荧光定量方法测定病毒转染后ins-1细胞txnip、atf5、xbp-1mrna的表达量。(4)westernblot方法测定病毒转染后,ins-1细胞txnip、chop、p-perk、perk、atf6、ire1α、p-ire1α、atf5蛋白的表达。(5)elisa方法检测caspase-3、caspase-12的表达量。(6)流式细胞术检测转染后ins-1细胞凋亡情况。结果:1、转染效率的观察和计算:如图2-1-1、2-1-2所示,用荧光显微镜观察并分别计算出ad-egfp组ins-1细胞转染24h、48h的转染率分别为(12.21±5.58)%、(40.22±3.47)%,ad-txnip-egfp组细胞转染24h、48h的转染率分别为(12.66±2.80)%、(41.28±3.84)%。由此可以看出无论ad-egfp组或ad-txnip-egfp组48h的转染率均高于24h(p<0.01),所以选用48h收集细胞进行后续实验。48h时ad-egfp组和ad-txnip-egfp组的转染率没有显著性差异(p>0.05),说明各组转染病毒量达到一致。2、腺病毒载体构建、txnip转染ins-1细胞成功2.1txnipmrna的表达量明显升高图2-2-1、2-2-2显示,与正常培养组相比,ad-egfp组ins-1细胞txnip表达量没有显著性差异(0.73±0.40vs.1.00±0,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组txnip表达量明显增高(16.56±2.99vs.0.73±0.40,p<0.01),说明病毒载体构建、细胞转染成功。2.2txnip蛋白表达量也明显增高图2-3-1、2-3-2中,与正常组相比,ad-egfp组ins-1细胞txnip蛋白表达量没有显著性差异(0.154±0.029vs.0.156±0.017,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组txnip蛋白表达量明显增高(0.527±0.089vs.0.154±0.029,p<0.01),进一步证实了病毒载体构建、细胞转染、目的基因过表达成功。3、过表达txnip可以引起ins-1细胞凋亡增加3.1caspase-3表达量明显增高ad-egfp组与对照组相比,ins-1细胞caspase-3表达量没有明显差异(0.80±0.18vs.0.68±0.26,单位:μg/ml,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组caspase-3表达量明显增高(2.50±0.49vs.0.80±0.18,单位:μg/ml,p<0.01),见图2-4。caspase-3代表了细胞凋亡的终末途径,ad-txnip-egfp组caspase-3表达量增高,说明过表达txnip可导致ins-1细胞凋亡增加。3.2流式法检测过表达txnip组ins-1细胞凋亡率增加ad-egfp组与正常组相比,ins-1细胞凋亡相对活性没有明显差异(11.77±1.20vs.10.18±1.57,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组ins-1细胞凋亡率增加(30.79±3.53vs.11.77±1.20,p<0.01),如图2-5-1、2-5-2示,进一步验证了过表达txnip可使ins-1细胞凋亡增加。4、内质网应激参与了txnip引起的ins-1细胞凋亡4.1chop蛋白表达量增高结果显示,同正常组相比较,ad-egfp组ins-1细胞chop蛋白表达量没有明显差异(0.21±0.04vs.0.20±0.03,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组chop蛋白表达量增高(0.36±0.06vs.0.21±0.04,p<0.05),见图2-6-1、2-6-2。chop是内质网应激通路的一个重要分子,它在线粒体通路和死亡受体通路中不被激活,所以它能反映内质网应激通路引起的细胞凋亡,txnip过表达组chop蛋白表达量增高,说明内质网应激通路介导了txnip引起的ins-1细胞凋亡。4.2caspase-12表达量增高与chop蛋白表达量变化一致,图2-7中,ad-egfp组ins-1细胞caspase-12表达量没有明显差异(0.46±0.07vs.0.46±0.05,单位:1×10-4μg/ml,p>0.05);与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组caspase-12表达量增高(1.35±0.13vs.0.46±0.07,单位:1×10-4μg/ml,p<0.05)。caspase-12同chop蛋白一样,都只是在内质网应激通路中被激活,反映了内质网应激介导细胞凋亡的情况,txnip过表达组caspase-12表达量增高,进一步显示内质网应激通路可以参与txnip引起ins-1细胞的凋亡。5、atf6α蛋白通路不参与txnip引起的ins-1凋亡ad-egfp组和正常组相比,ad-egfp组ins-1细胞atf6α蛋白表达量没有明显改变(0.54±0.05vs.0.52±0.08,p>0.05),与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组atf6α蛋白表达量也没有明显变化(0.57±0.06vs.0.54±0.05,p>0.05)。说明内质网应激通路中的atf6α蛋白通路不参与过表达txnip引起的ins-1细胞凋亡,图2-8-1、2-8-2。6、perk蛋白通路可能参与了txnip引起的ins-1凋亡6.1perk蛋白磷酸化升高结果显示,图2-9-1、2-9-2,与正常组相比,ad-egfp组ins-1细胞p-perk/perk没有明显改变(0.51±0.12vs.0.51±0.11,p>0.05),与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组p-perk/perk比值增高(0.73±0.12vs.0.51±0.12,p<0.05)。提示perk蛋白通路可能参与了内质网应激介导的ins-1细胞凋亡。6.2atf5mrna的表达量升高图2-10-1、2-10-2显示,同正常组相比,ad-egfp组ins-1细胞atf5mrna没有明显改变(0.93±0.26vs.1.00±0,p>0.05),与ad-egfp组相比ad-txnip-egfp组atf5mrna增高(1.63±0.22vs.0.93±0.26,p<0.05)。atf5是perk通路下游信号中的一个重要分子,过表达组atf5mrna的表达量升高说明perk-atf5这一通路可能参与了txnip引起的ins-1凋亡。6.3atf5蛋白的表达量也升高图2-11-1、2-11-2中可以看出,与正常组比,Ad-eGFP组INS-1细胞ATF5 mRNA没有明显改变(0.50±0.05 vs.0.48±0.04,P>0.05),与Ad-eGFP组相比Ad-TXNIP-eGFP组ATF5 m RNA增高(0.68±0.11 vs.0.50±0.05,P<0.05)。进一步说明了PERK-ATF5这一通路参与了TXNIP使内质网应激介导的的INS-1凋亡。7、IRE1α蛋白通路不参与TXNIP引起的INS-1凋亡7.1 IRE1α蛋白磷酸化变化不明显Ad-eGFP组INS-1细胞p-IRE1α/IRE1α没有明显改变(1.90±0.28 vs.1.92±0.29,P>0.05),与Ad-eGFP组相比Ad-TXNIP-eGFP组p-IRE1α/IRE1α也没有明显变化(1.94±0.30 vs.1.90±0.28,P>0.05),见图2-12-1、2-12-2。说明IRE1α蛋白通路可能不参与过表达TXNIP使内质网应激介导的INS-1细胞凋亡。7.2 sXBP-1 mRNA变化不明显XBP-1是IRE1α通路下游的一个重要分子,从图2-13-1、2-13-2可以看出,与正常组相比,Ad-eGFP组INS-1细胞sXBP-1 mRNA没有明显改变(0.96±0.17 vs.1.00±0,P>0.05),与Ad-eGFP组相比Ad-TXNIP-eGFP组sXBP-1 mRNA变化不明显(1.00±0.17vs.0.96±0.17,P>0.05)。剪接后的sXBP-1 mRNA没有明显变化,提示IRE1α对XBP-1的内切酶活性并没有变化,进一步说明了TXNIP过表达中IRE1α蛋白通路不参与内质网应激介导的INS-1细胞凋亡。结论:(1)单纯过表达TXNIP可以引起正常糖脂浓度培养下的INS-1细胞凋亡。(2)引起细胞程序性死亡的三条通路中,内质网应激通路可以参与TXNIP引起的INS-1细胞凋亡。(3)在TXNIP通过内质网应激介导INS-1细胞凋亡的三条蛋白通路中,PERK通路参与了这一过程,其余两条ATF6α通路和IRE1α通路没有参与。