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第一部分肌细胞增强因子2A RNA干扰促进小鼠主动脉内皮细胞炎症因子表达的实验研究研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一组血管病中常见的一种,是指动脉变硬,斑块形成,不稳定斑块对机体的危害比稳定斑块大,纤维帽薄,受到外力作用后容易破裂,导致血管内栓塞形成,造成相应器官缺血性坏死。肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor2A,MEF2A)是目前研究较多的与AS相关的生物活性物质,肌肉细胞中MEF2在血管生长发育过程中起重要作用。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象。运用RNA干扰的方法来降低小鼠主动脉内皮细胞(Mouse Aorta:Normal Aortic Endothelial Cells)MEF2A的表达,观察MEF2ARNA干扰对MEF2A表达以及对血管内皮功能的影响,为预防AS的发生提供理论依据。目的观察MEF2A RNA干扰对小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达的影响及细胞间黏附分子-1(ICAM-l)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达情况的变化。方法根据我们的设计,建立MEF 2A RNA干扰慢病毒或者阴性对照慢病毒(negative control,NC),滴度1×105 TU(transduction units)/ml.我们转染NC慢病毒或者MEF2A RNAi慢病毒载体(病毒感染复数=40)给小鼠主动脉内皮细胞,以此确定沉默效率。通过酶联免疫吸附试验和逆转录-聚合酶链反应测定MEF2A及ICAM-l、VCAM-1和PAI-1表达情况的变化。结果1.基因沉默分析显示MEF2A-site B降低小鼠主动脉内皮细胞MEF2A表达最有效。MEF 2A RNA干扰可明显降低MEF2A活性及其m RNA表达,且其作用呈剂量依赖性。在病毒感染复数(MOI)=40时作用达平台期。2.慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显促进小鼠主动脉内皮细胞ICAM-l、VCAM-1和PAI-1的活性及其m RNA表达。结论慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显抑制小鼠主动脉内皮细胞MEF 2A的表达,并促进血管内ICAM-l、VCAM-1和PAI-1的高表达。第二部分肌细胞增强因子2A RNA干扰促进载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化的实验研究研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一个慢性炎症过程,调控多种炎症介质基因表达的一种重要的转录因子NF-k B在病灶中的表达和活化均明显上调。病灶部位的SMC可能在某些病毒或化学因素的刺激下发生原癌基因的突变,这种基因突变导致SMC获得增生优势,并由此衍生成一群SMC,病灶中SMC的过度增殖看作是一种肿瘤发生现象,从基因/蛋白变异这一新的角度去研究动脉粥样硬化的发生机理。肌细胞增强因子2A(myocyte enhancer factor 2A,MEF2A)是一种新发现的维护血管内皮稳定性的重要生物活性物质,MEF2A表达水平的降低是AS形成的危险标志,越来越多的证据表明它在AS预防和病情判断方面具有重要意义。目前普遍认为AS是一种炎症性疾病,AS过程中炎症因子表达增加。实验证明,MEF2A与血管内皮完整性以及血管内致动脉粥样硬化的炎症因子具有相关,为判断AS的发生发展提供新的方法和途径。在我们的研究中,通过高脂喂养的方法,同时运用颈动脉缩窄性套管的方法,建立载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化动物模型,观察抑制MEF 2A表达对炎症因子表达的影响,同时对动脉粥样硬化斑块变化的影响,探讨它们的作用机制,为动脉粥样硬化的预防、诊断以及治疗提供指导和理论依据。目的运用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi),降低肌细胞增强因子2A的表达,特别是降低AS斑块局部的表达,通过抑制肌细胞增强因子2A表达,研究其对炎症因子的影响进而了解抑制肌细胞增强因子2A对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。方法选用apo E-/-小鼠,在小鼠的左颈总动脉上安置一个缩窄性硅胶套管,通过喂养高脂饮食,在其颈动脉上诱导动脉粥样硬化斑块形成。正中切开小鼠颈部皮肤,小心分离皮下组织和颈部肌肉,发现左颈总动脉后,在颈总动脉上放置一个长3mm、内径0.3mm的缩窄性硅胶套管,结扎丝线固定牢固。根据实验目的,将apo E-/-小鼠随机分为三个组:即:MEF 2A RNAi组、病毒阴性对照组(NC组)和对照组。另外,建立肌细胞增强因子2A RNA干扰慢病毒或NC慢病毒载体,4周后对动脉粥样硬化模型小鼠进行颈动脉斑块慢病毒转染,用生理盐水作为对照。8周后,对标本进行病理组织学检查,分别采用HE、MASSON和油红O染色;运用酶联免疫吸附试验和实时荧光定量-聚合酶链反应测定小鼠血液和颈部血管斑块局部肌细胞增强因子2A表达情况的变化以及炎症因子表达情况的变化。结果1.慢病毒转染4周后,肌细胞增强因子2A RNAi组无论是血液MEF2A浓度还是动脉粥样硬化斑块MEF2A m RNA表达水平都明显降低,与此同时,炎症基因表达水平均明显升高。2.抑制MEF2A RNA能明显促进动脉粥样硬化斑块形成,动脉粥样硬化斑块面积增加、斑块纤维帽厚度增厚、斑块胶原含量增多。与此相反,斑块脂质含量变化不明显。3.实验中,三个实验组间脂质含量水平均无显著性差异。抑制MEF2A RNA促进动脉粥样硬化斑块形成的作用独立于降脂作用之外。结论慢病毒介导的MEF2A RNA干扰可明显促进apo E-/-小鼠形成动脉粥样硬化,动脉粥样硬化斑块面积增加、斑块纤维帽厚度增厚、斑块胶原含量增多。第三部分急性冠脉综合症及稳定型心绞痛患者血浆MEF-2A及炎症相关因子水平变化的对比研究1研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病是一种由遗传因素和环境因素相互作用而引起的多基因疾病。CHD基本病理改变是冠状动脉粥样硬化,AS病变形成始动因素是内皮损伤,血液中单核细胞通过内皮细胞间隙沉积于内膜下,形成巨噬细胞,引起一系列血管炎性改变,脂质沉积、内膜增厚、血栓形成、斑块出现,形成动脉粥样硬化。本研究中,我们对其形成机制进行了对比性研究。目的检测急性冠脉综合症(ACS)患者、稳定型心绞痛(SAP)患者和健康对照组血清MEF-2A及ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平的变化,观察MEF-2A与ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a变化与冠状动脉病变程度之间的关系。方法采用ELISA法检测稳定型心绞痛、ACS患者及健康对照组血液MEF2A及ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平的变化,分析变化产生的可能机制。结果1.ACS组患者血液MEF 2A水平与SAP组和对照组相比明显降低;2.ACS组患者血液ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平与SAP组和对照组相比明显升高;3.血液MEF2A、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平在单只血管,双支血管及三支血管病变组患者间无显著性差异;4.在ACS组和SAP组中MEF 2A水平与ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平变化呈负相关。结论ACS和SAP患者血液MEF2A水平明显降低,且与ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平变化呈明显负相关。血液MEF2A、ICAM-1、VCAM-1、PAI-1、MCP-1、MMP-8、TNF-a水平变化对CHD、AS炎症反应和斑块的稳定程度评价具有重要的临床意义。