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楸皮酸(Juglanthraquinone C,JC)是一种从核桃楸茎皮中分离提取的天然蒽醌类化合物,具有诱导细胞凋亡的作用,但其具体机制尚不完全明确。本文主要以人类肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)HepG2和BEL-7402细胞为靶细胞探讨楸皮酸诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。为了找到活性更强的楸皮酸类化合物,我们分析了楸皮酸及其6种结构类似物的抗肿瘤构效关系。结果显示,楸皮酸比其它6种结构相似的化合物表现出更强的肿瘤细胞抑制活性。为了分析楸皮酸发挥抗肿瘤活性的具体机制,我们首先利用基因表达谱芯片技术分析了楸皮酸对肿瘤细胞内基因表达的影响。Affymetrix HG-U133 Plus 2.0微阵列结果显示,楸皮酸处理后增强了促细胞凋亡基因mRNA的水平,影响了细胞增殖和细胞周期相关基因的表达。为了证实楸皮酸对肿瘤细胞的凋亡诱导作用,我们利用DAPI染色技术检测了楸皮酸对HepG2和BEL-7402细胞核形态的影响。结果显示,经楸皮酸处理的HepG2和BEL-7402细胞出现明显的凋亡形态和凋亡小体。这些结果证实了楸皮酸可以诱导HepG2和BEL-7402细胞发生凋亡。为了阐明楸皮酸诱导凋亡的机制,我们对楸皮酸处理的细胞进行了基因表达谱芯片分析。结果显示,楸皮酸促进了HepG2细胞中4个正向调节Akt信号的基因mRNA的表达。免疫印迹结果进一步证实了楸皮酸的确激活了HepG2和BEL-7402细胞内PI3K/Akt信号通路。但是Akt信号通常被认为是促进肿瘤细胞增殖、存活和逃避凋亡的信号。为了研究楸皮酸诱导的凋亡与Akt激活之间的关系,我们首先运用RNA干涉技术降低了Akt的表达水平,免疫印迹检测显示,敲低Akt的表达抑制了楸皮酸诱导的肿瘤细胞凋亡。之后我们在细胞内过表达了野生型Akt、Akt激活突变体及其失活突变体,并检测了其对细胞凋亡的影响。结果显示,Akt激活突变体的表达促进了楸皮酸诱导的凋亡。这些结果提示,在楸皮酸诱导的HepG2和BEL-7402细胞凋亡过程中,活化的Akt信号发挥凋亡促进作用。为了详细解析Akt信号诱导肿瘤细胞凋亡的机制,我们对Akt下游的信号进行了进一步的分析。Foxo3a是Akt信号的下游靶标,之前的结果显示,楸皮酸抑制HepG2细胞中Foxo3a的核定位。本文的研究发现,楸皮酸增加了HepG2和BEL-7402细胞中Foxo3a的磷酸化水平,进而抑制了Foxo3a的核定位。在细胞中过表达Foxo3a明显降低了楸皮酸诱导的细胞凋亡。进一步的研究发现,Foxo3a的入核减少导致活性氧清除酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)的表达下降,引起细胞内活性氧水平升高。利用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和catalase能够抑制楸皮酸诱导的HCC细胞的凋亡。以上结果提示,楸皮酸可通过诱导HCC细胞内产生高水平的活性氧来诱导细胞的凋亡。综上所述,楸皮酸是通过激活Akt信号通路,抑制Foxo3a的转录活性,进而抑制活性氧清除剂的表达,提高细胞内活性氧的水平,最终导致HCC细胞凋亡。