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本论文研究内容包括两个部分,第一部分为克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因工程的研究;第二部分为那西肽产生菌活跃链霉菌(Streptomyces.actuosus)基因工程的研究。 第一部分 1932年,英国科学家弗来明发现了青霉素。它高效广谱的抗菌效果使之在临床上被广泛使用。然而伴随着青霉素日益广泛甚至过度的使用,导致了抗性病原体的产生。利用新型半合成抗生素是克服这种抗性病原体产生的唯一方法。半合成抗生素具有较少副作用、较小毒性、有较大的抗病原专一性、较宽抗菌谱和较好的药理学活性而主导着世界抗生素市场。青霉素G酰化酶(penicillin G acylase,PGA,EC 3.5.1.11)能水解青霉素G产生6-氨基青霉烷酸(6-APA),6-APA是半合成青霉素的关键中间体;另外,作为生物催化剂,PGA在许多有潜在价值的反应中也发挥了重要作用,例如多肽合成中保护氨基和羟基;PGA还可应用于氨基酸、β-氨基酯、胺类等手性化合物的拆分。拆分得到的纯的对映异构体可用作合成有生物活性组分的中间体。现已在许多微生物体内发现有该酶存在,如各种细菌、放线菌、真菌和酵母等。虽然大肠杆菌的PGA是工业应用上最为重要的来源,但开发和应用其他来源的PGA也取得了令人鼓舞的成果。与大肠杆菌的PGA相比,来自克莱博氏菌的青霉素G酰化酶具有对温度、pH的耐受性,与有机溶剂的共溶性,而且易固定化等优点。然而,到目前为止,对来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶的研究还主要集中于分子特性以及底物特异性的研究,系统地利用基因工程技术、发酵工程技术来研究和开发此酶在工业生产上的应用还未见报道。因此,本研究首次以来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶为研究对象,利用DNA重组技术将编码克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因克隆入质粒pET28b,获得一个C端含6个组氨酸的融合蛋白表达载体pETKcPGA。在LB培养基中,