蛋白质组学是在细胞、组织的整体蛋白质水平上对其活动规律进行研究的学科。“Shotgun”(鸟枪法)策略是蛋白质组学中常用的研究策略。在该策略中,对样品的酶解是基础而关键的步骤,它直接影响到蛋白鉴定的结果。为了改善自由酶的稳定性差、酶解效率低等问题,研究者们开展了对自由酶进行固定化的研究。尽管固定化酶的酶解效率有所提升,但是也存在一些不足。在酶解过程中,疏水性载体易对蛋白产生不可逆吸附,造成酶解后载体对肽段释放率较低,而亲水性载体使蛋白质难以靠近,从而低丰度蛋白酶解不完全。这些问题导致蛋白质的检出率降低,甚至严重影响鉴定结果。因此,改善固定化酶的性质,并实现其亲疏水性的可控调节,对蛋白质组学中高效样本处理具有重要意义。基于此,本文创新性地将pH/温度双重敏感性智能微球与固定化酶技术相结合,成功构建出兼具刺激响应性和酶生物活性的智能载酶微球体系,并将其运用于蛋白质的酶解处理过程。研究工作主要从双敏智能微球的制备与表征、智能微球结构的调控、智能微球载酶体系的构建及其在蛋白质组学中的应用等方面展开。主要研究内容如下:(1)采用快速膜乳化技术结合低温一步聚合法,以聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)和聚丙烯酸(PAAc)为原料,在微米尺度上成功制备出pH/温度双重敏感性的半互穿网络结构微球(PPS)。通过对快速膜乳化技术的工艺参数进行优化,可制备出平均粒径在6.5?m左右、粒径分布均一的智能微球。利用红外光谱(FT-IR)、扫描电子显微镜(SEM)、激光粒度仪和差示扫描量热仪(DSC)对微球的结构和性能进行分析,证实了半互穿网络结构的有效形成。对微球的刺激响应性能表征发现:微球具有较好的温度敏感性和pH敏感性,且两种刺激响应性之间不会相互影响。另外,与PNIPAM微球相比,PPS微球的分散性和储存稳定性有大幅度提升,这为其在生物化工领域的应用奠定良好基础。(2)为了实现对智能微球的结构调控,改变亲水组分和交联剂的含量制备了一系列智能微球,对微球的结构与性能之间的关系进行了探讨,并结合透光度法和凝胶时间测定对聚合过程中微球内部相分离行为进行分析。研究发现,随着PAAc投入量的增加,微球表面的褶皱区域尺寸和内部孔洞尺寸减小,但微球始终保持贯穿孔结构。随着aac投入量的增加,微球的表面从多孔逐渐变为少孔,并且微球的结构从较为均匀的半互穿网络结构向“核-壳”型半互穿网络结构转变。交联剂对微球结构和性能的影响更为明显,其投入量的增加,可以使微球从松散的结构转变至较均匀的半互穿网络结构,直至最后转变为“核-壳”型半互穿网络结构。基于多种分析数据,本文提出不同交联剂浓度下,智能微球的半互穿网络结构模型。(3)采用共价固定法,将胰蛋白酶与智能微球载体材料相结合,成功构建出智能载酶微球系统。在前期工作的基础上,以p(nipam-co-aac)无规共聚结构微球(pca)为载体,对固定化酶的过程进行分析,并优选出最佳参数。在此条件下,又以半互穿结构微球为载体,构建智能载酶微球体系,并探讨其酶学性质和刺激响应性质。研究表明,所制备的载酶体系保持了较好的酶活性和刺激响应性,且酶固载量高。同时,固定化酶的最适催化温度与微球载体材料的临界相转变温度(lcst)接近。另外,由于载体是阴离子型载体,三种固定化酶的最适催化ph均向碱性方向移动。在25~45°c温度范围内,与自由酶相比,固定化酶的最大反应速率有较大提升,还具有更好的热稳定性和储存稳定性。(4)基于上述对不同智能载酶微球系统的性能评价,利用智能载酶微球系统的刺激响应性,对细胞色素c(cyt-c)、肌红蛋白(myo)及牛血清白蛋白(bsa)三种模型蛋白进行酶解。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(maldt-tofms)和液相色谱-质谱联用仪(lc-msms)对酶解效果进行分析。研究发现,智能载酶微球体系具有较高的酶解效率和较好的酶解效果,5min内即可将cyt-c酶切。与其他载酶体系相比,智能微球载酶体系对模型蛋白酶解15min,所鉴定得到的肽段数目和序列覆盖率更高。这是由于智能微球载酶体系可以在高于lcst温度下对蛋白分子进行吸附和酶解,并在低于lcst的温度下对肽段进行有效的释放。另外,try-pps和try-pcps还展现出可优先选择小分子蛋白进行酶解的能力。这些优势与特点,使得智能微球载酶体系可以进一步应用于酶解复杂蛋白混合物领域中。(5)以智能微球载酶系统为基础,分别通过调节体系温度、调节体系ph值以及结合红外辅助酶解技术,对hepg2细胞提取物进行酶解,并对酶解产物进行生物信息学分析。结果表明,与常规条件下进行酶解相比,采用红外加热方式,或者在加热过程中调节体系ph至6.0,均能提高酶解效率。在红外条件下,利用try-pcps酶解30min后,产物中所检测到的匹配蛋白最多(116个)。对检测所得的蛋白质的理化性质进行分析,结果表明,60%以上的蛋白质分子量小于40kda。大部分蛋白的等电点处于4.5~9.5,过酸或过碱蛋白含量很低。蛋白的gravy值几乎小于0,说明检测到的蛋白大多数为疏水性蛋白。对这些鉴定的蛋白进行分类,发现大部分蛋白质具有催化活性,并且参与代谢过程,与细胞的转运、迁移、分化、增殖、防御应答等相关,由此可见肝脏所承担的生理功能很多,是人体的代谢中枢。本论文利用快速膜乳化技术结合低温一步聚合法,在微米尺度上成功制备出具有温度和pH双重敏感性的互穿网络结构水凝胶微球,并完成了智能载酶微球体系的构建及其用于酶解复杂蛋白质混合物的研究。本文首次提出“高温富集酶解,低温释放肽段”这一酶解新思路,并开拓了一种新型的蛋白质快速高效酶解方法,这有助于拓展智能温敏水凝胶微球在蛋白质组学领域中的应用,同时为后续的研究工作提供理论基础。