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真核基因的转录调控是细胞内基因表达调控网络的基础,胞内编码蛋白的基因和核内小RNA(snRNA)的转录主要依赖于RNA聚合酶Ⅱ。而其所控制的转录过程由起始复合物组装、转录起始、启动子区清理、转录延伸、转录终止等5步依次协同完成。在正性转录延伸因子b(P-TEFb)发现之前,人们一直认为转录前起始复合物的组装和转录的起始是调控真核基因转录的关键步骤。但随着研究人员对P-TEFb转录调控方面越来越深入的探索,发现转录延伸同样受到严密及精细的调控且是基因转录的限速步骤。P-TEFb以无活性和有活性两种形式存在细胞内。其中无活性的P-TEFb主要“束缚”在7SK snRNP复合物中,而有活性的P-TEFb主要包括BRD4-P-TEFb复合物和超级延伸复合物(Super Elongation Complexs,SECs)。本实验室的前期研究发现:7SK snRNP复合物通过钙离子依赖性PP2B和PP1 a信号途径,协同对CDK9/Thr186进行去磷酸化作用,导致P-TEFb从7SK snRNP中释放出来。以及BRD4-P-TEFb和SECs复合物通过不同的募集通道协同调控RNA聚合酶Ⅱ暂停解除。而去磷酸化的CDK9/Thr186必须重新活化,即CDK9/Thr186重新获得磷酸化才能恢复P-TEFb的激酶活性。目前,对于去磷酸化的CDK9/Thr186在细胞内什么位置以及如何重新组装成有活性的P-TEFb等方面的研究尚未阐明。已有报道,Nuclear Speckle是组装、储存、修饰剪接因子的空间,而SR蛋白(SRSF1,SRSF2等),作为Nuclear Speckle中主要的剪接因子,除了能够在RNA的修饰加工中发挥作用,还能促进调控活性P-TEFb的转录延伸。在前人报道的基础上,本研究选用HeLa cells和稳定表达Flag-CDK9的F1C2作为细胞研究模型,采用HMBA刺激作为药物刺激模型,通过基因体内过表达、沉默、核酸分级抽提以及免疫荧光等实验技术,对于去磷酸化的CDK9/Thr186重新磷酸化机制和细胞内位置行了研究,我们的研究结果发现:有活性的P-TEFb组分分布在高盐溶液溶液中,而低盐中是无活性的P-TEFb组分。通过免疫荧光实验我们发现,P-TEFb相关的蛋白BRDU/AFF1/AFF4/ELL2也出现在Speckle中,同时发现磷酸化的CDK9/Thr186也分布在Speckle中。接下来,我们依据UV照射导致DNA损伤,PolⅡ降解,转录无法继续的原理,对高盐溶液组分进行IP实验。结果显示,即使染色质被破坏,有活性的完整P-TEFb依然存在。并且荧光观察也看到有活性的P-TEFb相关蛋白因子(CDK9、CyclinT、BRD4、SECs等)在Speckle中有明显聚集,这些结果说明,Nuclear Speckle是调控有活性P-TEFb的关键场所。此外,我们通过敲除和过表达实验,证实BRD4、AFF1和AFF4是CDK9募集到Speckle的关键因子,而CyclinT则是通过ELL2定位于Speckle的。即P-TEFb中的CDK9和CyclinT是通过不同的蛋白因子非同步定位于Speckle的,换句话说P-TEFb相关组分是在被募集到Speckle之前发生解离的。综上所述,结合本实验室之前的研究结果,我们发现:Nuclear Speckle是去磷酸化的CDK9/Thr186重新获得磷酸化完成重组装的关键场所。而HMBA的刺激导致CDK9/pT186位点去磷酸化,使P-TEFb从无活性复合物中释放出来的同时也使CDK9与Cyclin T发生了解离,然后被分别募集到Speckle中完成组装和重磷酸化。这些发现对进一步揭示和完善P-TEFb活性调控相关的分子机制有着重要的意义。