在哺乳动物中,脾脏作为一个次级的淋巴和网状内皮器官,具有破坏衰老红细胞、储存血细胞和抗感染以及髓外造血的多种功能。脾脏作为免疫相关器官,具有能够连接先天免疫和适应性免疫以及保护机体免受感染的能力,在调节免疫稳态等方面起着重要作用。先天无脾是一种罕见的疾病,其特征是出生时没有脾脏,被称为原发性免疫缺陷。先天无脾患者对侵袭性感染的易感性增加,尽管有积极的治疗,但死亡率很高。与脾脏切除患者一样,先天无脾患者更容易受到爆发性肺炎球菌感染。在小鼠的研究中,表达在脾原基中的转录因子包括tlx1、nxk3.2、wt1、tcf21、nkx2.5、pbx1和sox11在对小鼠的脾脏发育至关重要,并且这些基因的缺失将导致小鼠脾脏发育不全或者先天无脾。在鱼类中,关于脾脏发育的早期调控未见报道。脾脏作为鱼类最大的淋巴和免疫器官之一,包含椭球体系统和多种免疫细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞和粒细胞,在吞噬和捕获抗原方面发挥着积极的作用。而关于鱼类脾脏缺失条件下,受病原体感染后的免疫应答及其机制研究还未见报道。本研究以斑马鱼为模型,首先确定了斑马鱼胚胎中与小鼠同源的脾脏标记基因的表达模式,然后利用CRISPR/Cas9基因敲除技术对脾脏发育关键基因进行了靶向敲除,验证其在脾脏发育中的功能。分析了相应突变体在病原体感染后的免疫缺陷。具体研究结果如下:1.通过CRISPR/Cas9基因敲除技术成功建立了先天无脾斑马鱼模型。WISH（whole-mount in situ hybridization）结果显示与小鼠同源的脾脏标记基因nkx3.2、wt1、tcf21、nkx2.5和sox11在斑马鱼中呈现不同的表达模式,然而并不在早期发育的脾脏中表达;tlx1早在胚胎发育至52 hpf（hours post fertilization）时在脾原基处开始表达,并且随着胚胎的发育,tlx1在早期脾脏的表达也随之升高。组织分布分析显示,nkx2.5、wt1a、tcf21和tlx1均在成鱼的脾脏中高表达,其中tlx1特异的高表达于脾脏中。随后我们通过CRISPR/Cas9基因敲除技术获得了第一个外显子上增加8 bp（+8）和缺失25 bp（-25）的2种tlx1-/-纯合突变体,并且均无脱靶现象。通过早期肝脏标记基因（lfabp）和早期胰腺标记基因（tryspin）的表达分析发现tlx1的缺失并不影响胰腺和肝脏的早期发生。与WT（wild-type）相比,在tlx1-/-纯合突变体中,表达tlx1的脾原基细胞在52 hpf时明显减少,并且在53 hpf时完全消失。同时TUNEL（Terminal Deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin Nick End Labeling）细胞凋亡结果显示,在52 hpf时,tlx1-/-突变体中细胞凋亡信号比WT中明显增加,并且在对应的脾原基处存在成团的凋亡细胞,表明tlx1的缺失可能导致了脾原基细胞发生程序性凋亡,从而影响了早期脾原基的正常发育。随后解剖学观察结果显示,tlx1-/-突变体的脾脏完全缺失,tlx1基因的缺失导致斑马鱼先天无脾而无其他器官异常。2.先天无脾损害了斑马鱼的早期免疫反应。对早期胚胎的存活率统计分析发现tlx1-/-突变体幼鱼的早期存活率显著低于WT。补体系统相关基因（c3a.4、c3a.6和c4）和碱性磷酸酶（alpl）在tlx1-/-突变体幼鱼中的表达显著低于WT,单核细胞吞噬系统的标记基因b7r在tlx1-/-突变体幼鱼中几乎检测不到表达,同时在嗜水气单胞菌攻毒后,tlx1-/-突变体幼鱼的死亡率显著高于WT。这些结果预示了先天无脾可能损害了斑马鱼的免疫系统,降低了斑马鱼对病原菌的抵抗力。在嗜水气单胞菌攻毒以及LPS（Lipopolysaccharide）处理后,促炎症相关因子（il1β、il6、tnfα、tnfβ和nfkb2）在tlx1-/-突变体幼鱼中的表达显著的高于WT,然而抗炎症因子il10却无明显变化,并且同样检测不到b7r的表达;酶联免疫吸附法（ELISA）结果显示,Il1β、Il6和Tnfα的蛋白水平同样显著高于WT,预示着先天无脾导致的炎症反应失控以及单核细胞吞噬系统的受损。与WT相比,在tlx1-/-突变体幼鱼中,嗜水气单胞菌攻毒导致大量的炎症相关细胞在肠道尾部大量聚集,并且TUNEL细胞凋亡结果显示大量凋亡细胞聚集在肠道部位,细胞凋亡程度显著高于WT。在LPS处理后,在tlx1-/-突变体幼鱼的鳃以及尾部均观察到大量的凋亡细胞聚集;相反,WT斑马鱼幼鱼的鳃以及尾部仅发现少量TUNEL阳性细胞。在CuSO4诱导的急性炎症反应中,tlx1-/-突变体幼鱼的死亡率显著高于WT,并且与WT相比,tlx1-/-突变体中向侧线迁移的炎症细胞数量显著增加。在成鱼中,tlx1-/-突变体在标准实验室条件下能够正常存活及繁殖,但是在嗜水气单胞菌攻毒后其死亡率显著高于WT。在嗜水气单胞菌攻毒后,促炎症因子（il1β、il6、tnfα）在tlx1-/-突变体肾脏（头肾和体肾）中的表达显著高于WT,b7r的表达同样缺失。H&E染色（hematoxylin-eosin staining）结果显示,在灭活疫苗以及LPS处理后,与WT相比,tlx1-/-突变体的肾小管组织出现明显的空泡化,细胞结构破坏。TUNEL细胞凋亡结果显示,与WT相比,在灭活疫苗以及LPS处理后的tlx1-/-突变体中凋亡的肾小管细胞的数量明显增多。3.先天无脾扰乱了斑马鱼的免疫稳态,从而导致先天免疫和适应性免疫受损。在腹腔注射灭活嗜水气单胞菌后,分别对WT和tlx1-/-突变体完整的肾脏（头肾和体肾）进行转录组测序以研究先天无脾对先天免疫和适应性免疫应答的影响。在先天免疫阶段,与WT相比,应激反应相关的生物学过程（细胞趋化、对细菌的反应、对外部生物刺激的反应、对其他生物的反应、对生物刺激的反应、趋化因子介导的信号通路、白细胞趋化、白细胞迁移、炎症反应等）、炎症和细胞凋亡相关信号通路（TNF信号通路、RIG-1受体信号通路和P53信号通路）以及促炎细胞因子/趋化因子（il1β、il6、tnfα、tnfβ、il13、il13ra2、cxcr4a、elf3、cxcl8a、cxcl18b、csf1b、ccl20a.3、ccl39.3等）在tlx1-/-突变体中显著上调。同时,在tlx1-/-突变体中,肝脏和肠道的促炎症相关基因（il1β、il6、tnfα、tnfβ和nfkb2）的表达显著的高于WT,表明先天无脾可能扰乱了免疫稳态,从而导致了斑马鱼过度的系统炎症。此外补体系统相关基因（c3a.1、c3a.6、c4、c6、c9）、抗原呈递及抑菌相关基因（defbl1、hamp、tapbp.1、tap1）以及造血系统相关基因（tfr1a、gfi1b、nfil3、prg4b、sae1）在tlx1-/-突变体中的表达均显著低于WT。在适应性免疫阶段,与WT相比,适应性免疫相关生物学过程（T细胞激活、T细胞激活调控、T细胞增殖正调控、T细胞共刺激、T细胞增殖、淋巴细胞增殖等）以及适应性免疫相关信号通路（T细胞受体信号通路）在tlx1-/-突变体中均显著下调。免疫球蛋白相关基因如:igl1c3、igl3v5、ighv1-4、ighv2-1和ighv9-1在tlx1-/-突变体中的表达显著低于WT。此外定量PCR结果显示,与WT相比,tlx1-/-突变体的MHCII/Ig M表达也显著降低。综上所述,本研究通过CRISPR/Cas9基因敲除技术成功获得了tlx1-/-纯合突变体,证明了tlx1是鱼类脾脏发育的一个关键调节基因,并成功获得了先天无脾斑马鱼模型。先天无脾可能部分的损害了斑马鱼的补体系统以及单核细胞吞噬系统。此外,先天无脾扰乱了斑马鱼的免疫稳态,导致过度的系统炎症及炎症损伤,从而导致先天免疫和适应性免疫反应受损。本研究不仅为非哺乳脊椎动物提供了脾脏机能缺失研究模型,研究结果丰富了我们对鱼类脾脏发育及早期调控的知识,也对人类脾脏切除或先天无脾患者的病理和临床医学提供参考。