营养素负平衡是奶牛围产期(产前21 d-产后21 d)的典型生理特征,为满足机体营养需要,奶牛大量动员体组织的脂质、蛋白质和其它营养素。机体营养素的大量动员易造成一系列代谢性疾病,如酮病和脂肪肝,并诱发肝脏和其它器官的氧化应激及免疫抑制,降低肝脏功能和机体健康。胆碱和蛋氨酸(Met)因其在奶牛肝脏一碳单位循环、脂质氧化和转运及机体健康方面的益生功效,已受到关注。目前,现有研究仍存不足:(1)奶牛围产期营养平衡和营养生理的变化规律尚未完全理清,评价指标不系统不准确;(2)添加过瘤胃胆碱(RPC)和过瘤胃蛋氨酸(RPM)时,不考虑基础日粮蛋白质含量,且研究深度不够,缺乏多指标、多层次的系统性探究;(3)胆碱和蛋氨酸调控肝细胞能量和脂质代谢的信号通路尚不明确。基于以上问题,本研究在评价围产期奶牛机体营养平衡和生理参数的动态变化(试验1)的基础上,从能量代谢和机体健康(试验2)、蛋白质平衡和产后泌乳性能(试验3)及新生犊牛体尺参数和营养生理(试验4)多个方面,综合研究RPC和RPM对奶牛围产期营养代谢的调控,并以非酯化脂肪酸(NEFA)刺激构建LO2肝细胞模型(试验5),探究胆碱和蛋氨酸调控肝细胞脂质和能量代谢的关键信号通路和调节因子(试验6),为RPC和RPM在围产期奶牛上的应用提供理论依据和技术参考。试验1.奶牛围产期营养平衡的评估及血液代谢参数的动态变化为明确奶牛围产期机体营养平衡和营养生理参数的动态变化,为后续试验和营养实践提供基础资料,本试验选取14头健康经产的中国荷斯坦奶牛,整个干奶期采食同一日粮(1.51 Mcal/kg NEL和11.92%CP,干物质基础,下同),分娩后转入泌乳日粮(1.69Mcal/kg NEL和15.02%CP)。日粮瘤胃可降解淀粉(RDS)分别为20.17%和18.06%,物理有效中性洗涤纤维(peNDF)分别为peNDF1.18=28.71%和24.24%及peNDF8.0=18.58%和16.60%,因此日粮碳水化合物平衡指数(CBI=peNDF/RDS)分别为CBI1.18=1.42和1.34及CBI8.0=0.92和0.92。干奶前期为日粮适应期,正试期为整个围产期,即干奶后期(围产前期)和泌乳早期(围产后期),共42 d,每天或每周采集相关样品,进行实验室分析、计算和模型预测。结果发现,围产前期奶牛机体泌乳净能(NEL)、代谢蛋白质(MP)和代谢葡萄糖(MG)均不存在负平衡,而分娩后均出现负平衡,且产后第7 d负平衡最为严重,NEL、MP和MG的缺乏量分别为5.76 Mcal/d、254.42 g/d和387.54 g/d;随分娩的临近,奶牛DM、NEL、MP和MG摄入量均下降,分娩当天(0 d)达到最低,较第-21 d分别下降39.27%、39.30%、39.45%和32.82%,分娩后逐渐回升;从-21d到21d,奶牛血液生理代谢参数和相关综合指数均呈现不同程度的二次曲线变化,极值多出现于第0和7d,此时奶牛体脂动员最为严重,神经内分泌显著改变,肝脏功能和机体健康均明显下降。上述结果表明,围产期奶牛nel、mp和mg的负平衡均出现于围产后期,但围产前期奶牛生理代谢参数、器官功能和机体健康已发生改变,可见奶牛围产期营养调控应从围产前期开始。试验2.过瘤胃胆碱和过瘤胃蛋氨酸对奶牛围产期能量平衡和健康的影响本试验旨在研究日粮添加rpc(15g/d,以氯化胆碱计)和rpm(15g/d,以dl-met计)对奶牛围产期能量平衡和机体健康的影响,选取48头健康、经产的中国荷斯坦奶牛,采用2×2因子试验设计,按配对设计原则分为4组,每组12头奶牛,分别为对照组(基础日粮)、基础日粮+rpc、基础日粮+rpm和基础日粮+rpc+rpm。基础日粮同试验1,干奶后即开始预饲围产前期日粮,分娩后转入泌乳日粮,试验期为整个围产期(-21d至21d),评价相关指标。结果显示,日粮添加rpc提高了奶牛产后第14d的采食量,rpm对采食量无影响,rpc和rpm均可促进奶牛围产后期的能量平衡(eb),而对产前eb无影响;rpc和rpm均可降低血浆nefa和β-羟基丁酸(bhba)含量,并提高血浆葡萄糖和极低密度脂蛋白(vldl)含量;rpc提高了奶牛肝脏活力指数(lai)和肝脏功能指数(lfi),rpm亦具有提高lfi的趋势,rpc和rpm均具有提高修正的定量胰岛素敏感检测指数(rquicki)的趋势;日粮添加rpc和rpm提高了血浆总抗氧化能力(t-aoc)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)活性和维生素e的含量及外周血t淋巴细胞亚群比例(cd4+/cd8+),并降低了血浆丙二醛(mda)、白细胞介素6(il-6)和肿瘤坏死因子α(tnf-α)的含量。研究表明,日粮添加rpc和rpm可缓解奶牛围产期能量负平衡,改善肝脏功能,促进机体健康。综合上述和其它评价指标(详见第三章),rpc在调控奶牛围产期能量平衡方面更有优势。试验3.过瘤胃胆碱和过瘤胃蛋氨酸对奶牛围产期蛋白质平衡、氨基酸代谢和产后泌乳性能的影响本试验旨在探究rpc和rpm对奶牛围产期机体蛋白质平衡、氨基酸代谢和产后泌乳性能的影响,试验设计和奶牛饲养管理均同试验2。研究发现,rpm具有促进奶牛围产期全期机体mp平衡的趋势,rpc不影响全期mp平衡,但rpc和rpm均具有提高产后第14dmp平衡的趋势;rpc和rpm均显著降低了血浆3-甲基组氨酸(3-mh)的含量,rpm还降低了血浆尿素氮(pun)含量,rpc对pun无影响;rpc和rpm均提高或趋于提高奶牛血浆总氨基酸(taa)、总必需氨基酸(teaa)、蛋氨酸(met)、亮氨酸(leu)和牛磺酸(tau)的含量;添加rpc和rpm提高了奶牛泌乳早期4%乳脂校正乳产量(4%fcm,对照组、rpc组、rpm组和rpc+rpm组分别为22.70、23.42、23.31和23.94kg/d)和乳脂率,rpm可提高乳蛋白率,而rpc对乳蛋白的影响不显著,仅在数值上有所提高;rpm提高了乳中组氨酸(his)含量,并具有提高met含量的趋势,rpc具有提高乳中his含量的趋势,但不影响met含量。以上结果表明,日粮添加rpc和rpm可减少机体蛋白质动员,促进蛋白质平衡,并调控机体氨基酸代谢,提高产后泌乳性能,且rpm对奶牛氨基酸代谢的调控效应优于rpc。试验4.围产前期添加过瘤胃胆碱和蛋氨酸对新生犊牛体尺指标和血液参数的影响为确定围产前期奶牛日粮添加rpc和rpm对胚胎生长发育、营养生理和机体健康的影响,在试验2和3的基础上,检测新生犊牛体尺重及血液理代谢、肝脏新生犊牛体尺重及血液理代谢、肝脏功能、抗氧化和免疫状态等指标。围产前期试验设计和饲养管理均同试验2,犊牛出生后立即称量体重,测量体尺,颈静脉采血,测定相关指标。结果表明,除rpc增加尻宽,以及rpm增加腰角宽外,rpc和rpm对犊牛初生重和其它体尺指标、指数均无影响;rpc具有提高新生犊牛血糖的趋势,rpm则具有提高pun的趋势,而血浆nefa、bhba、vldl和3-mh含量均无显著变化;rpm提高了新生犊牛血浆met和半胱氨酸(cys)浓度,并具有提高tau浓度的趋势;rpc亦趋于提高血浆met和cys浓度,但不影响tau浓度;rpc和rpm均提高或趋于提高血浆胰岛素样生长因子1(igf-1)含量,但对其它内分泌指标均无影响;rpc降低了血浆tnf-α含量,并具有提高血浆t-aoc和外周血t淋巴细胞cd4+/cd8+的趋势;rpm具有提高血浆t-aoc和降低tnf-α的趋势,但对cd4+/cd8+无影响。可见,rpc和rpm可不同程度影响新生犊牛蛋白质和氨基酸代谢,提高血浆部分氨基酸及葡萄糖和igf-1含量,并改善机体抗氧化和免疫功能,这些变化对犊牛生长发育的后续影响有待进一步研究。试验5.nefa和bhba对肝细胞能量和脂质代谢、氧化应激和炎症反应的影响本试验以lo2肝细胞为试验对象,研究bhba和nefa对肝细胞能量和脂质代谢、氧化应激和炎症反应的影响,在此基础上,为后续研究建立细胞模型。首先,设计不同浓度梯度,bhba和nefa的梯度均为0、0.5、1.0、1.5、2.0和4.0mmol/l,每浓度6重复,细胞处理时间均为24h,以细胞增殖、氧化还原参数及腺苷一磷酸激活的蛋白激酶α(ampkα)和tnf-α的表达量为评价指标。结果发现,随bhba和nefa浓度的升高,细胞增殖、抗氧化能力和ampkα表达量逐渐降低,tnf-α表达量逐渐升高;根据研究需求综合考量,最终确定bhba和nefa后续试验浓度均为1.5mmol/l。其次,试验设4个处理,分别为对照组、bhba组、nefa组和混合添加组,每组6个重复,处理时间为24h,测定相关指标,研究表明,bhba和nefa均不同程度影响ampkα、肝脏x受体α(lxrα)、过氧化物酶体增殖激活受体α(pparα)、固醇调节元件结合蛋白1c(srebp-1c)等调节因子的表达,进而抑制肝细胞脂肪酸氧化、合成和转运等靶基因的表达;bhba和nefa均抑制肝细胞红系衍生的核转录相关因子2(nrf2)抗氧化通路,并激活核因子κb(nf-κb)炎症通路。研究表明,较高浓度(1.5mmol/l)的bhba和nefa均可抑制肝细胞能量和脂质代谢,并降低抗氧化能力,诱导细胞炎症反应。nefa1.5mmol/l可用于构建肝细胞模型,以模拟体脂动员时肝细胞的生存环境。试验6.胆碱和蛋氨酸对NEFA肝细胞模型能量和脂质代谢的调控在前期动物试验和细胞模型基础上,本试验旨在研究胆碱(氯化胆碱,下同)和Met对NEFA肝细胞模型能量和脂质代谢关键基因和蛋白表达的影响,并确证AMPKα信号通路在这一过程中的作用。为精准控制培养基中胆碱和蛋氨酸含量,本试验采用无胆碱无蛋氨酸的定制培养基,施加处理前,细胞在无血清的定制培养基中饥饿6 h。经筛选,胆碱和Met的适宜浓度分别为50和300μmol/L,设空白对照组(无胆碱无Met)、胆碱组(50μmol/L)、Met组(300μmol/L)和混合添加组(50μmol/L胆碱+300μmol/L Met);后续试验中,在培养基中加入AMPKα抑制剂BML-275(10μmol/L),每个处理均设6个重复,处理时间24 h,测定相关生化指标及基因和蛋白的表达量。研究发现,胆碱和Met可提高AMPKα蛋白的磷酸化水平(p-AMPKα/AMPKα),提高PPARα基因和蛋白的表达量,降低LXRα和SREBP-1c基因和蛋白的表达量,进而改变下游靶基因的表达量,促进脂肪酸氧化和载脂蛋白合成关键基因的表达,抑制脂肪酸和酮体生成相关基因的表达;胆碱和Met均可增强细胞抗氧化能力,激活Nrf2抗氧化通路,降低TNF-α基因和蛋白的表达量;当加入BML-275时,肝细胞p-AMPKα/AMPKα显著下降,此时胆碱和Met对肝细胞能量和脂质代谢相关调节因子及其靶基因的调控效应明显下降。以上结果表明,胆碱和Met可通过调控AMPKα通路及一些调节因子(LXRα、PPARα和SREBP-1c)的表达,调控肝细胞能量和脂质代谢,促进肝细胞脂肪酸氧化和载脂蛋白合成,抑制脂肪酸合成和酮体产生。此外,胆碱和Met还可改善肝细胞氧化还原状态,减少氧化和炎性损伤。本研究表明,胆碱和Met可通过激活肝细胞AMPKα信号通路和调节LXRα、PPARα和SREBP-1c等因子的表达,调控肝细胞能量和脂质代谢,减少脂质蓄积,并通过Nrf2和NF-κB通路降低NEFA诱导的肝细胞氧化应激和炎症反应;同时,日粮RPC和RPM可影响奶牛围产期机体内分泌,整合调控奶牛围产期能量、脂质和氨基酸代谢,促进肝脏和机体健康,缓解能量和蛋白质的负平衡,并改善产后泌乳性能和新生犊牛相关指标。