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由模式识别受体(pathogen recognition receptors,PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-asociated molecular patterns,PAMPs)而引起的天然免疫反应是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线?当病毒进入细胞后会被细胞内的PRR——维甲酸诱导基因(retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)样受体(RIG-I like receptors,RLRs)家族成员识别,而激活下游一系列信号,导致干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)3和IRF7的磷酸化激活和二聚体的形成,从而起始I型干扰素(type I interferon,IFN-I)的产生,最终诱导下游抗病毒效应蛋白的表达和获得性免疫反应的激活。RLR家族的两个重要的成员RIG-I和黑色素瘤分化基因5(melanoma differentiation-associated gene,MDA5)具有广泛的识别病毒核酸的功能,在抗病毒先天性免疫中起到非常重要的的作用。但有意思的是,RIG-I同源基因在某些鱼类[如大黄鱼(Pseudosciaena crocea)]、鸡(Gallus gallus)和中国树鼩(Tupaia belangeri chinensis)的基因组中没有被鉴定到,而MDA5同源基因几乎存在于所有被研究的脊椎动物中。这似乎暗示RIG-I和MDA5的功能存在冗余性。目前的研究表明RIG-I与MDA5在识别的核酸类型上存在差异,对某些病毒的识别存在冗余,但人们对二者在I型IFN诱导作用方面的差异性却知之甚少。草鱼(grass carp,Ctenopharyngodon idella)是我国―四大家鱼‖之一,其养殖业长期以来受到各种疾病的困扰。由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)病毒——草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病严重影响着草鱼种的成活率,因此GCRV和草鱼抗病毒免疫系统长期以来受到科研人员的广泛关注。在研究过程中,草鱼的RIG-I和MDA5基因也被克隆和鉴定出来,并且被证明在抗GCRV感染中发挥着积极的作用。最近,随着高通量测序技术的发展,草鱼的IFN成员被充分地挖掘并鉴定出来。草鱼I型IFN包括四个成员,即IFN1、IFN2、IFN3和IFN4;而II型IFN包含两个成员,即IFN-γrel和IFNγ。人们对其他鱼类各IFN的研究表明不同的IFN在功能上存在差异,但对各IFN的诱导通路的认识还比较模糊,草鱼这6种IFN在细胞中的相对表达模式也还不清楚。因此我们想利用草鱼肾细胞系(C.idella kidney,CIK)为研究对象,来探究草鱼IFN的表达特征;重点用GCRV感染CIK细胞,来研究草鱼RIG-I和MDA5在IFN诱导方面的差异性。我们利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和双荧光素酶报告试验技术,发现未受到免疫刺激的CIK细胞中IFN1和IFN3基因相对表达量较高,IFN-γrel和IFNγ基因表达量居中,IFN2和IFN4基因表达量较低;在GCRV或dsRNA类似物poly(I:C)刺激细胞后,各IFN和代表性IFN刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达量在草鱼MDA5过表达细胞中显著高于RIG-I过表达细胞;而且MDA5过表达比RIG-I过表达更为强烈地促进了各IFN启动子活性。为了探究产生这种现象是否与IRF3和IRF7相关,我们又利用细胞活力检测、RT-qPCR和免疫印迹(immunoblotting,IB)技术证明了草鱼IRF3和IRF7在GCRV感染后由细胞质向细胞核迁移,并在细胞抗GCRV感染过程中发挥着重要的作用。随后我们使用半定量(semi-qPCR)、双荧光素酶报告试验、IB技术发现,在细胞未受到免疫刺激时,RIG-I和MDA5的过表达不会影响IRF3和IRF7的表达;但在细胞受到免疫刺激时,RIG-I和MDA5的过表达会在蛋白水平上显著促进IRF3和IRF7的表达,并上调了它们的磷酸化水平。之后,我们使用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和IB技术深入研究了草鱼RIG-I和MDA5对IRF3和IRF7的影响。结果发现,RIG-I和MDA5过表达促进了IRF3和IRF7的丝氨酸磷酸化;不同的是,MDA5同时也促进了IRF7的苏氨酸磷酸化,但RIG-I却抑制了IRF7的苏氨酸磷酸化。这一现象导致的结果是:RIG-I和MDA5过表达促进了IRF3与IRF7的异源二聚化,同时MDA5过表达也促进了IRF7的同源二聚化,但RIG-I过表达却削弱了IRF7的同源二聚化作用。随后为了探究草鱼IRF3和IRF7二聚化对各IFN表达的影响,我们运用了双荧光素酶报告试验。结果表明:IRF3的同源二聚化仅促进了IFN1的启动子活性,而IRF3和IRF7的异源二聚以及IRF7的同源二聚更为广泛而强烈地促进了I型IFN的启动子活性。由此说明了IRF7的同源二聚在I型IFN启动诱导中的重要作用,也阐明了RIG-I比MDA5对IFN表达的诱导作用弱的分子机制。最后,我们又利用RT-qPCR技术证明MDA5过表达诱导的白介素4(interleukin4,IL-4)和IL-12p40基因表达量显著高于RIG-I过表达所诱导的表达量,从而为MDA5诱导了更高的II型IFN基因表达提供了理论依据。本研究表明草鱼MDA5比RIG-I诱导的IFN免疫反应更为强烈,为RIG-I和MDA5在功能上的冗余性提供了证据,同时也解释了为什么RIG-I同源基因可以在某些脊椎动物中缺失而不至于过多影响其先天性免疫应答。