第一部分PPAR-α激动药和PPAR-α过表达对ET-1诱导的心肌细胞肥大及PI3K/Akt/GSK3 β-NFTc4通路的影响。 目的：PPAR-α是核受体PPARs的一种亚型，主要在心脏表达，充当了心肌肥厚的抑制因子。日益增多的证据表明，PPAR-α的下调和灭活可能参与了高血压左心室病变的发病过程。尽管PPAR-α已经被报道是心肌肥厚的重要调节因子，但是PPAR-α激活后抑制心肌肥厚的机制还未完全明了。因此，我们采用PPARα激动药非诺贝特(fenofibrate)和PPAR-α-EGFPN3质粒作为干预药物，研究了PPAR-α激活后是否通过：PI3K/Akt/GSK-3 β-NFATc4通路抑制内皮素-1(endothelin-1，ET-1)诱导的心肌肥大反应。 方法：本研究以体外培养的新生SD大鼠的心肌细胞作为试验模型，通过构建PPAR-α-EGFPN3质粒来研究：PPARα过表达对ET-1诱导的Akt/GSK-3 β磷酸化和ET-1诱导的NFATc4核转位的影响。采用[<3>H]亮氨酸掺入法、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Westem blot)技术、免疫荧光技术、免疫共沉淀技术等方法，观察了(1)非诺贝特对ET-1诱导的心肌细胞肥大及表型转变的影响；(2)ET-1对PPAR-α mRNA和蛋白表达的时效关系；(3)非诺贝特和PPAR-α过表达对ET-1诱导的Akt/GSK3 β磷酸化的影响；(4)非诺贝特和PPAR-α过表达对ET-1诱导的NFATc4核转位的影响；(5)非诺贝特对PPAR-α和NFATc4相互作用的影响；(6)非诺贝特对ET-1诱导的AP-1表达的影响。 结果： 1.PPAR-α激动剂非诺贝特(10 μmol/L)显著抑制了ET-1诱导的肥厚反应(心肌细胞表面积、蛋白质合成和ANF的表达的增加)。 2.以10 nmol/L的ET-1刺激，PPAR-α mRNA的表达在1h、3h、6h出现降低，以3h和6h降低较为明显；而PPAR-α蛋白的表达在3h、6h出现降低，其中以3h降低最为显著。 3.10 nmol/L ET-1作用3h后，Akt 473位和GSK3 β 9位丝氨酸磷酸化表达显著增加；以非诺贝特(10 μmol/L)预处理1h，ET-1诱导的Akt和GSK3 β的磷酸化被显著降低；LY294002(10 gmol/L，P13K抑制剂)可以阻断ET-1诱导的Akt/GSK3 β磷酸化。 4.PPAR-α过表达或PPAR-α过表达联用非诺贝特(10 μmol/L)可以显著抑制ET-1诱导的Akt/GSK3 β磷酸化。 5.非诺贝特和PPAR-α过表达防止了ET-1诱导的NFATc4由胞浆到胞核的转位。 6.在心肌细胞中PPAR-α和NFATc4之间存在相互作用，但在非诺贝特处理时，二者之间的作用被加强。 7.非诺贝特抑制了ET-1诱导的AP-1的表达；LiCl(10 mmol/L)处理逆转了非诺贝特对AP-1的作用，增加了ET-1诱导的AP-1的表达。 结论： 1.ET-1可能通过激活P13K/Akt?GSK-3 β-NFATc4通路和下调PPAR-α诱导心肌肥厚的发生。 2.PPAR-α激活后可能通过抑制P13K/Akt/GSK-3 β-NFATc4通路抑制ET-1诱导的心肌肥大反应。 第二部分RNA干扰沉默PPAR-α对ET-1和非诺贝特调控的心肌细胞肥大及P13K/Akt/GSK3 β-NFALTc4通路的干预效应。 目的：本研究的目的是阐明PPAR-α在病理性心肌肥厚中的作用及其机制。我们应用siRNA有效沉默PPAR-α，调查了PPAR-αsiRNA和PPAR-α激动剂非诺贝特在ET-1诱导的Akt/GSK3β磷酸化和NFATc4核转位中的作用；验证了非诺贝特对心肌肥厚的抑制作用是PPAR-α依赖性的这一假说。 方法：应用siRNA有效沉默心肌细胞PPAR-α的表达；采用RT-PCR和Western-blot试验检测了Invitrogen’s Stealth RNAi对PPAR-α基因的沉默效应和序列特异性；运用[<3>H]亮氨酸掺入法和RT-PCR检查了心肌细胞蛋白质合成和ANF mRNA的表达；采用Western-blot技术研究了ET-1和非诺贝特对P13K/Akt/GSK3β信号通路的影响及PPAR-α siRNA对其的干预作用。 结果： 1.与对照组相比RSS304167，RSS304168和RSS304169可分别减少PPAR-α的mRNA表达70﹪，92﹪，and 62﹪；同时，RSS304167，RSS304168和RSS304169可以分别降低PPAR-α蛋白表达49﹪，75﹪，and 44﹪；此外，RSS304168并不影响PPARβ/δ的PPAγ的mRNA和蛋白表达。 2.和转染对照组相比，ET-1刺激使心肌细胞蛋白质的合成增加大约70﹪(1.7.3 ±0.12 fold vs.negative control)，但RSS304168处理增加了ET-1诱导的蛋白质合成，和转染对照组相比，RSS304168联用ET-1组蛋白质合成增加大约120﹪；此外，ET-1显著增加了ANF的mRNA表达(1.76 ±0.12 fold vs.negativecontrol)而RSS304168加强了ET-1的这种作用(2.14 ±0.16 fold vs negativecontrol)。 3.应用RSS304168沉默PPAR-α后，非诺贝特抑制心肌细胞蛋白质合成和ANF表达的作用被显著逆转。 4.利用RSS304168沉默PPAR-α基因后，非诺贝特降低ET-1诱导的Akt/OSK3β磷酸化的作用被取消；而ET-1刺激的Akt/GSK3β的磷酸化水平被升高，但这种作用可被P13K阻断剂LY294002所阻断。 5.PPAR-α基因沉默后，ET-1诱导NFATc4核转位的作用被加强；而非诺贝特抑制ET-1诱导的NFATc4核转位的作用被RSS304168逆转。 结论：ET-1通过激活P13K/Akt/GSK3 β-NFATc4通路诱导心肌细胞肥大反应，这种作用可能与PPAR-α有关；非诺贝特以PPAR-α依赖的方式抑制了P13K/Akt/GSK3 β-NFATc4通路，防止了心肌肥大的发生。 第三部分非诺贝特对压力超负荷大鼠左心室肥厚及心肌组织Akt/GSK3 β-NFATc4信号通路的影响。 目的：本实验通过缩窄大鼠腹主动脉建立心肌肥厚模型，研究了非诺贝特逆转AAB大鼠左心室肥厚的作用，初步探讨了P13K/Akt/GSK3 β途径和NFATc4在非诺贝特调控的心肌肥大过程中的信号转导作用，从分子水平上为逆转高血压LVH提供新的理沦和实验依据，也为临床防治高血压LVH提供新的治疗思路。 方法：采用腹主动脉缩窄法(AAC)建立心肌肥厚模型。健康SD雄性大鼠50只，体重150±10g，随机分为：(1)假手术组；(2)假手术组+非诺贝特(80 mg/kg per day)组；(3)AAC组；(4)AAC+非诺贝特(80 mg/kg per day)组。 结果： 1.与对照组相比，大鼠腹主动脉缩窄4周后，AoSP、AoDP、LVESP以及LVEDP明显升高；+dp/dtmax和-dp/dtmax明显减少，这说明AAC大鼠出现了心脏收缩、舒张功能的障碍，在体心功能明显下降。而非诺贝特治疗后，±dp/dtmax明显上升；AoSP、AoDP、LNESP无明显变化而LVEDP稍降。 2.与对照组相比，手术后4周AAC大鼠的室间隔(IVSd和IVSs)及左室后壁厚度(PWTd和PWTs)均明显增加，同时左室收缩期内径减小(LVEDS)而舒张期内径(LVEDD)无明显变化，呈现出明显的向心性肥厚。经非诺贝特治疗后，其左室肥厚得到明显逆转，左室后壁厚度显著减小，左室内径明显增大，与相应模型组比较，均具有显著性差异。此外，与对照组相比，AAC组左心室重量指数(LVM/BW)和心肌细胞横切面积增加，差异具有显著性。经非诺贝特治疗后，其左心室指数和心肌细胞横切面积显著低于相应的模型组。 3.与对照组相比，AAC组的胚型基因ANF和β-MHC的mRNA表达增加；而非诺贝特治疗后，ANF和β-MHC的mRNA表达均显著下降。 4.与对照组相比，AAC大鼠Akt/GSK3 β的磷酸化水平明显增加；给予非诺贝特治疗后，AAC大鼠的Akt/GSK3 β磷酸化水平明显下降。 5.与假手术组相比，AAC大鼠心肌组织NFATc4的表达升高；而非诺贝特治疗部分逆转了AAC大鼠增高的NFATc4的表达。同时，在各组大鼠均能观察到：PPAR-α和NFATc4的相互作用的存在，而非诺贝特增强了二者之间的相互作用。 结论：非诺贝特能够在一定程度上防止AAC大鼠左心室肥厚及心肌细胞表型转变，而且这一效应与血压下降无关。Akt/GSK3 β和NFATc4信号通路可能参与AAC大鼠左心室肥厚的病理生理过程，非诺贝特通过抑制这些通路的激活防止了AAC大鼠左心室肥厚的发生。