近些年来，猪的病毒性疾病时常危害着养猪业的正常发展，研究表明猪α-干扰素具有显著的抗病毒功能，对猪的很多种病毒性传染病，如流行性腹泻、猪瘟、蓝耳病、传染性胃肠炎等都有一定防治效果。目前，利用基因工程手段研制和开发重组干扰素制剂已成为研究热点，并已有多种类型干扰素产品成功上市，但仍远远满足不了市场需求。本文对猪IFN-α密码子序列进行了优化改造，并采用原核表达系统对猪IFN-α成功进行了表达，纯化及抗病毒活性研究，为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。 一、猪α-干扰素基因序列的改造与克隆 本研究在前期获得猪IFN-α基因序列的基础上，根据大肠杆菌的偏嗜性，对其密码子序列进行改造。改造后的猪IFN-α-基因序列与原序列相比，碱基改变79个，占全基因序列的16％；密码子改变63个，占总密码子数的38％;基于原序列中含有5个编码半胱氨酸的密码子，为防止蛋白折叠中二硫键的错配，将第86位半胱氨酸密码子(UGC)改造为酪氨酸密码子(UAC)，使得Cysl-Cys99，Cys29-Cys139之间形成两个分子内二硫键。改造后序列以引物的形式分段合成，采用重叠延伸PCR(SOE PCR)进行依次扩增，并最终获得改造后的猪IFN-α全基因序列；将改造后的猪IFN-α基因克隆到pMT-Easy载体中，酶切及测序鉴定结果表明成功构建克隆载体pMT-poIFN-α。 二、重组猪α-干扰素的原核表达、鉴定与纯化 重新设计引物，并引入Ndel、EcoRI酶切位点，构建重组猪α-干扰素的原核表达载体pET28-poIFN-α，酶切及测序鉴定正确后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，添加IPTG诱导表达；经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约21kDa的位置出现明显的新生蛋白条带，与目的蛋白分子量大小相近，采用Western Blot对其进一步进行鉴定后，表明重组猪α-干扰素成功获得了表达。目的蛋白为N端带有(His)6标签的融合蛋白，主要以包涵体形式存。对表达条件(诱导时间、温度及IPTG浓度)进行优化后，目的蛋白占到菌体总蛋白的39.8％，实现了重组猪α-干扰素在大肠杆菌中的高效表达。表达产物经镍琼脂糖亲和层析方法进行纯化后，目的蛋白纯度达到90％以上，获得了较高纯度的重组猪α-干扰素。 三、重组猪α-干扰素抗病毒活性研究 纯化后的重组猪α-干扰素经流加稀释法复性后，采用MDBK/VSV与PK15/VSV系统分别鉴定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性，并采用微量细胞病变抑制法，通过MDBK/VSV系统测定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性效价约为2.19×106 U/mg，获得了具有较高活性的重组猪α-干扰素，为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。