研究背景Humanin (HN,脑神经肽)是由日本学者Hashimoto在对AD患者枕叶进行DNA功能检测时发现的一个由24个氨基酸残基组成的(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala)线性多肽家族,已被体外证明对AD(阿尔兹海默氏病)神经毒性Aβ多肽及β-淀粉样前体蛋白诱导的神经元细胞坏死具有保护作用。Rattin是在鼠类体内发现一种新型的编码38个残基的分泌性脑神经肽类似物(比人类脑神经肽Humanin长14个残基),与人类脑神经肽有73%的一致性,Caricasole A等研究认为Rattin能对抗Aβ淀粉样蛋白诱导的神经细胞毒性及家族性阿尔茨海默病的基因突变,具有抗细胞凋亡作用,且能更有效地对抗NMDA诱导的兴奋性神经元损伤,Rattin的识别鉴定可能是药理学治疗的新途径,其目的旨在提高内源性脑神经肽样类似物的产生。血管性认知功能损害是指由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的一种获得性智能损害综合征,是一种慢性的进行性疾病,已成为继阿尔茨海默病(AD)后的第二大痴呆疾病。混合性痴呆既阿尔茨海默氏病(AD)合并血管性痴呆,临床上并不少见。最近的研究表明,血管性痴呆和AD占据相同的频谱的两端,两者存在共同的血管因素和重叠的临床和病理生理特点。国内外实验证实HN及其衍生物具有潜在的抗细胞凋亡和神经保护活性,拮抗NMDA的神胞毒性作用,且对调节胆碱能系统具有巨大的潜力,对AD,急性缺血性再灌注损伤及药物所致认知功能损伤具有神经保护作用。经文献检索目前HN类似物对慢性脑缺血灌注不良所致血管性认知缺损的研究未见报道,因此我们首次检测HN类似物Rattin在慢性脑血管缺血致认知功能损害大鼠海马和皮层的表达,以证实其对慢性血管性认知损害可能产生的影响。目的通过检测一种新型的HN衍生物Rattin基因及蛋白质在血管性痴呆大鼠脑内的表达,探讨Rattin的表达及其对对认知功能损害可能产生的影响。材料和方法1.动物模型的制备1.1实验动物Animals健康中年雄性SD大鼠30只,体重260-300g,由中国山东中医药大学动物中心提供。随机分为假手术组12只(sham-operated group, SOG),手术组18只(VD model group, MDG)。双侧颈总动脉永久性结扎术(bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO)为国际公认血管性痴呆模型常用方法,我们采用BCCAO制备血管性痴呆模型,模拟慢性脑低灌注状态下的认知功能损害。具体操作方法：10%水合氯醛(0.30ml/100g)腹腔注射麻醉,颈前部去毛,消毒后沿腹侧颈正中切开,气管旁分离出双侧颈总动脉,以“0”号线双重结扎颈总动脉。SOG组动物行颈前切开,分离但不结扎颈总动脉。1.2大鼠空间学习记忆能力测试术前1天及术后第31天,采用Morris水迷宫实验测试大鼠的空间学习记忆能力。Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于检测大鼠空间学习记忆的常用装置,分为定位航行实验及空间探索实验两部分,参照有关文献方法于泰山医学院动物实验中心完成测试。1.3行为学测试结果统计学处理：实验数据以x±s表示,组间比较采用t检验,所有数据采用运用SPSS13医学统计学软件处理。应用水迷宫实验对两组大鼠学习记忆成绩进行比较,结果表明MDG组大鼠的逃避潜伏期较SOG组明显延长(P<0.01), MDG组大鼠的跨平台次数较SOG组明显减少(P<0.01)。说明MDG大鼠学习记忆能力降低,造模成功。1.4大鼠标本的取材大鼠模型制作及分组成功,1月取材,用10%水合氯醛0.35ml/100g麻醉大鼠,,常规胸腹联合切口,经左心室插管,分别用生理盐水、4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液灌注固定,将大鼠断头处死,标记标本的组别和时间点。,随机抽取模型组6只,假手术组6只,从视交叉处向后将大脑切成约3mm厚的薄片,梯度酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,以备Nissl染色使用。剩余模型组6只,假手术组6只大鼠迅速分离脑组织,剥取海马,枕叶及颞叶皮层置液氮中,于-80℃低温冰箱保存,分别用于组织总RNA及总蛋白的提取,备real time-qRT-PCR, Westernblotting使用。1.5病理学观察：Nissl染色取鼠海马及颞叶皮层脑切片,依次放入二甲苯和梯度酒精中脱蜡,PBS (0.01mol/L, pH7.4)洗涤后,放入1%的甲苯胺蓝染液中染色数分钟。染色后经95%酒精快速分化,二甲苯透明,最后用中性树脂封片。光学显微镜下观察大鼠海马和颞叶皮层细胞,可见神经元内Nissl体染色呈紫兰色。模型组痴呆大鼠海马CA1区锥体细胞层次减少,排列稀疏,胞浆内尼氏体消失,细胞核体积变小,深染,结构不清,呈核固缩表现,神经纤维排列紊乱；假手术组大鼠海马CA1区锥体细胞2-3层,排列紧密,细胞核圆而大,核仁清晰,胞浆内尼氏体丰富,神经纤维密集,排列整齐；假手术组大鼠颞叶皮层锥体细胞形态正常、结构清晰、Nissl体含量丰富；模型组痴呆大鼠颞叶皮层神经细胞核固缩,局限性神经元数目减少,胶质细胞增生。2.试验方法2.1检测Rattin蛋白在大鼠不同脑区的的表达Western blot分别检测两组大鼠海马,颞叶和枕叶皮层三个部位Rattin蛋白的表达。Rattin蛋白检测：提取Lowry法测蛋白含量。采用Western印迹方法检测Rattin蛋白的相对含量。用凝胶成像分析仪采集图像并用软件进行分析。GAPDH作内参照。操作步骤：(1)组织总蛋白样品的制备(2)细胞总蛋白样品的定量(3)SDS-PAGE凝胶电泳(4)转膜(5)免疫反应(6)膜重新杂交内参GADPH2.2检测Rattin基因在大鼠海马,颞叶和枕叶皮层的表达实时荧光定量PCR分别检测两组大鼠海马,颞叶和枕叶皮层三个部位Rattin基因的表达。RattinmRNA检测方法：用Trizol法提取总RNA; RNA鉴定和定量；反转录反应；PCR反应；取目的基因和GAPDH的PCR产物各5μl,2%琼脂糖凝胶电泳。全自动凝胶成像分析系统照相得到目的基因与GAPDH的扩增产物的积分光密度值(Ⅰ),计算二者的比值(Ⅰ目的基因/IGAPDH),以此作为目的基因的相对表达量。操作步骤：(1)组织总RNA提取(2)反转录反应：RNA反转录成cDNA(3)PCR扩增cDNA:Rattin and β-actin的引物序列：Rattinl5’-TTAGGGACTAGAATGAATGG-3’;Rattin25’-AACTAGTAAATTGAAGCTCC-3’; β-actin a,5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’; β-actin b,5’-TCTGCTGGAAGGTGGACAGT-3。配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)；三步法PCR；融解曲线方法：相对定量；数据处理方法：2-ΔΔC(t)2.3统计学处理：应用SPSS13.0统计软件处理,数据以平均数±标准差(x±s)表示,多组间均值的比较用SNK法单因素方差分析。结果1.模型组(MDG)与假手术组(SOG)Rattin蛋白表达量比较MDG组大鼠颞叶及枕叶皮层Rattin蛋白表达量与对照SOG组比较未见明显差异(P>0.05,P>0.05); MDG组大鼠海马与颞叶及枕叶皮层Rattin蛋白表达量对比明显增高(P<0.01,P<0.01); SOG组大鼠海马与颞叶及枕叶皮层之间Rattin蛋白表达量比较明显降低P<0.01,P<0.01), SOG组大鼠颞叶及枕叶皮层之间Rattin蛋白表达量比较未见明显差异(P>0.05)。2.模型组与假手术组Rattin基因表达量比较模型组(MDG)与假手术组(SOG)之比结果分析采用2-ΔC(t)方法。在基因水平上对Rattin进行定量分析,通过荧光实时PCR检测显示：MDG组与对照组颞叶和枕叶Rattin表达比较无显著差异(P>0.05,P>0.05); MDG组海马区Rattin基因表达量比对照组明显增高(P<0.01)；SOG组海马与颞叶,枕叶比较Rattin表达有显著降低(P<0.01, P<0.01), SOG组颞叶,枕叶间Rattin表达无明显差异(P>0.05)。讨论近几年的研究发现HN类似物Rattin对AD及AD以外的认知功能缺损有神经保护作用,其机制可能与抗NMDA毒性,调节神经胆碱乙酰转移酶和囊泡内乙酰胆碱运载体mRNA表达有关,同时具有调节氧化应激反应,减少细胞凋亡,保护血管内皮细胞的功能,HN类似物的分泌活性是在其基因序列中进行编码的,HN必须被分泌到细胞外才能发挥它的抗AD相关损伤的神经保护功能。目前认为人类HN多表达在能量代谢相关的组织,如心脏,骨骼肌,肾脏和肝脏,在免疫系统中几乎未检测到,在脑区小脑和枕叶比其他部位表达更显著,脑脊髓液,精液和血浆中也见表达。Yun K. Oha发现在人类乳房内动脉,动脉粥样硬化的冠状动脉,大隐静脉的内皮细胞也可见HN的表达,HN可通过调节进展斑块的氧化应激反应和细胞凋亡保护血管内皮细胞功能,防止动脉粥样硬化斑块的进展。Caricasole A报道了鼠类HN类似物基因,命名为rattin (RN),证明Rattin是一种新型种族发育相关性脑神经肽,具有针对Aβ和兴奋性神经元死亡的保护活性。我们首次在慢性脑灌注不良所致认知功能损害的大鼠模型海马,枕叶,颞叶中检测Rattin的表达,以探讨其可能发生的改变。本实验通过Western blot, RT-PCR方法检测HN类似物Rattin蛋白及基因在血管性痴呆大鼠海马和颞叶,枕叶皮层的表达,首次发现慢性脑灌注不良致血管性痴呆大鼠海马Rattin表达显著增高,而颞叶,枕叶皮层Rattin表达没有变化,此结果提示海马神经细胞可能通过自身分泌Rattin发挥一定的神经保护作用,Rattin表达增高可能与学习记忆损害有关,这种增高可能是一种反应性神经保护作用。海马神经元缺血可致神经元皱缩,数目减少,细胞内胞质贫乏,核糖体、线粒体和内质网数量减少,胞浆内含有大量溶酶体和细胞丝,突触前膜或后膜肿胀、空化,由此造成与认知损害有关的神经递质如乙酰胆碱,兴奋性氨基酸,神经肽等异常,同时激发Rattin的表达增高。Terashita K,研究显示人脑中脑神经肽在小脑和枕叶的表达高于其他脑区,正常大鼠各脑区Rattin在海马的表达最低,枕叶最高,本实验大鼠正常对照组海马,颞叶和枕叶Rattin表达未见显著差异,另一方面,双侧颈动脉永久性结扎致慢性脑缺血累及海马,颞叶为主,颞叶皮层受损亦可引起近事记忆缺损,实验显示颞叶Rattin表达没有变化,此结果及机制有待于进一步研究。结论Rattin作为一种新型脑神经肽类似物对慢性缺血性血管性痴呆可能具有一定的神经保护活性,此结果为血管性认知缺损发病机制的研究和药物治疗提供新的方向。