【摘 要】
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副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis,G.parasuis）是一种引起猪格拉瑟氏病（Glasser’s disease）的重要致病菌,给全球养猪行业造成巨大的经济损失。研究表明,猪感染G.parasuis后表现出一系列炎症反应并且许多G.parasuis流行株毒力尚未明确。micro RNA（miRNA）是一类约为22 nt的内源性非编码单链小RNA,具有高度的保守性,对生物体
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副猪嗜血杆菌（Glaesserella parasuis,G.parasuis）是一种引起猪格拉瑟氏病（Glasser’s disease）的重要致病菌,给全球养猪行业造成巨大的经济损失。研究表明,猪感染G.parasuis后表现出一系列炎症反应并且许多G.parasuis流行株毒力尚未明确。micro RNA（miRNA）是一类约为22 nt的内源性非编码单链小RNA,具有高度的保守性,对生物体生长、发育及免疫等生命活动具有重要的调控作用。目前,调控G.parasuis感染宿主后诱导炎症反应与致病过程的miRNA及其功能仍然未知。本研究构建G.parasuis XX0306菌株感染动物模型,借助于高通量测序技术检测G.parasuis XX0306菌株感染仔猪后肺组织miRNA表达谱的变化,筛选差异表达miRNA,利用生物信息学对差异表达miRNA进行靶基因预测,以揭示G.parasuis感染发病过程中miRNA的表达谱特征与潜在功能;同时,体外构建了G.parasuis感染3D/421细胞模型,探究筛选的ssc-miR-135与ssc-miR-155-3p的生物学功能,进一步揭示二者在G.parasuis致病过程的免疫调控作用,为探究G.parasuis致病机制提供新的思路。1.G.parasuis感染仔猪动物模型构建及致病性研究通过构建G.parasuis感染动物模型,从临床症状、病理特征、炎性因子表达等方面系统地分析G.parasuis XX0306菌株的致病性。结果表明:（1）仔猪感染G.parasuis XX0306菌株后出现被毛杂乱、发热、关节肿大、跛行、咳嗽与呼吸困难等典型临床症状,生长受到抑制,解剖后发现心脏呈典型的“绒毛心”病变,肺组织变脆、有出血,且胸腔有纤维素渗出物,发生黏连。（2）组织病理学检测观察到处理组仔猪心脏的肌纤维断裂,伴随出血与炎性细胞浸润;肺脏中肺泡大部分消失,肺泡壁增厚,伴随出血与炎性细胞浸润,呈现间质性肺炎,并且其它脏器也出现不同程度病理变化。（3）检测发现处理组仔猪的肺组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6与IL-8的转录水平均显著高于对照组,其中TNF-α、IL-1β差异显著（p＜0.05）,IL-6、IL-8差异极显著（p＜0.01）。并且血清中炎性因子IL-1β与IL-8分泌增加（p＜0.01）。研究证实5型G.parasuis XX0306菌株对仔猪有较强的致病作用,G.parasuis感染动物模型构建成功。2.G.parasuis感染仔猪后肺组织miRNA表达谱分析通过高通量测序技术对感染G.parasuis XX0306菌株仔猪肺组织的miRNA表达谱进行分析,筛选差异表达miRNA;通过GO与KEGG富集分析差异miRNA在G.parasuis感染过程中发挥的生物学功能。结果表明:（1）共鉴定出1151个miRNA,其中有25个差异表达,16个上调与9个下调。（2）通过GO和KEGG富集分析,差异miRNA靶基因显著富集在432个GO条目和137个KEGG通路中,许多与炎症反应和免疫调控相关,推测在仔猪感染G.parasuis过程中差异miRNA起着重要的免疫调控作用。（3）筛选10个表达丰度较高且变化幅度明显的miRNA进行qRT-PCR验证,发现这些miRNA表达模式均与测序结果保持一致,表明测序结果可信,为后续深入研究奠定了基础。3.ssc-miR-135与ssc-miR-155-3p对G.parasuis感染3D4/21细胞的调控功能研究对筛选的ssc-miR-135与ssc-miR-155-3p进行靶基因和炎症通路分析,利用构建的G.parasuis感染3D4/21细胞模型进一步研究二者的免疫调控作用。研究发现:G.parasuis XX0306菌株攻毒后细胞存活率极显著下降（p＜0.01）,ssc-miR-135与ssc-miR-155-3p对细胞存活率无显著影响。G.parasuis感染细胞过程中,ssc-miR-135通过诱导IκBα蛋白降解进一步激活NF-κB信号通路,促进炎性因子IL-6（p＜0.05）和IL-8（p＜0.01）的表达。ssc-miR-155-3p亦能够显著抑制TNF-α（p＜0.01）、IL-1β（p＜0.05）和IL-8（p＜0.05）的表达,然而其调控机制还有待进一步研究。
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