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肠出血性大肠杆菌 O157:H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7)是一种肠道致病菌,它主要是通过摄入被污染的食物或水,或与带菌动物接触使人感染,严重可致死亡。大肠杆菌O157:H7感染已逐渐成为威胁人类健康的重要公共卫生问题,建立快速、灵敏度高的检测方法是防控大肠杆菌O157:H7感染的关键。量子点是一种新型的纳米材料,具有优良的荧光特性。与其它的免疫学分析法相比,基于量子点的免疫分析法在特异性、敏感性和准确性方面具有巨大的优势,在食品微生物检测中有广阔的应用前景。本研究采用大肠杆菌O157:H7菌体作为免疫抗原,制备出抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体,并在此基础上通过对水溶性核壳量子点、量子点-抗体偶联物和免疫层析的研究,制备荧光免疫层析试纸条,为大肠杆菌O157:H7的快速检测提供了一种新方法。本研究的研究内容包括:大肠杆菌O157:H7多克隆抗体的制备:大肠杆菌O157:H7热灭活后制备成免疫抗原,对新西兰大白兔皮内多点注射免疫,成功制备抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体,经过辛酸-硫酸铵法纯化后,抗体效价为1:25600,纯化后抗体蛋白质浓度为4.07 mg/mL。采用SDS-PAGE凝胶电泳测得纯化抗体杂带较少,纯化效果较好,分子量约为152kD。水溶性核壳量子点的制备及条件优化:采用无机水相合成法,以巯基丙酸为稳定剂在水溶液中合成CdTe/CdS核壳量子点。通过单因素实验对CdTe/CdS量子点的制备条件进行优化,得到各影响因素的最优水平为:Cd2+与Te2-的摩尔比为5:1,稳定剂MPA与Cd2+的摩尔比为2.5:1,反应体系pH为9,反应温度为95℃,CdTe核的回流时间为1 h;CdS壳的回流时间为1 h。在此条件下,合成QDs的荧光强度为726.41,较初始条件,荧光强度增大50.10%,量子点的粒径约为3.0 nm,分散性好,相较CdTe量子点,核壳结构的CdTe/CdS量子点的荧光强度、稳定性大大提高。量子点与抗体偶联:采用直接偶联和共价偶联两种方法将量子点与抗体偶联。通过琼脂糖凝胶电泳和荧光图谱验证量子点与抗体偶联成功,共价偶联法效果较好。对偶联影响因素进行优化:pH为7.4,0.01 mol/LPBS缓冲体系中,37℃摇床避光反应1.5 h,100 μL CdTe/CdS量子点与80 μL 1 mg/mL抗大肠杆菌O157:H7多克隆抗体反应,偶联效果最好。荧光免疫层析试纸条的组装与评测:将量子点标记的抗体用于检测大肠杆菌O157:H7,在硝酸纤维素膜上用大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和羊抗兔IgG分别作检测线和质控线,应用免疫层析技术制备荧光免疫层析检测试纸条,根据是否出现荧光条带判定样品中是否含有大肠杆菌O157:H7。对试纸条的制备条件进行优化:控制线羊抗兔IgG的最适浓度为1 mg/mL,检测线兔多抗的最适浓度为1 mg/mL。试纸条具有较好的属外特异性,不与其它的菌发生反应;属内不与其它大肠杆菌反应,与大肠杆菌O157:H7的不同分离株反应强烈。试纸条的检测限为104-105 CFU/mL,在室温避光保存35 d,试纸条可以正常使用。