研究背景阿司匹林耐受不良呼吸道疾病(Aspirin-exacerbated respiratory disease, AERD)以哮喘、鼻息肉及阿司匹林不耐受为特点,即患者服用或吸入阿司匹林或其它非选择性环氧合酶-1(cyclooxygenase-1, COX-1)印制剂后出现急性呼吸系统反应,又称Samter’s三联征。国外的研究表明,该病大约占成人哮喘的7%,但占了重度哮喘的14%,我国关于该病的报道较少,但近年来,随着阿司匹林在我国的广泛应用,AERD的发病率和检出率正在不断增高。AERD是公认的难治性鼻窦炎的一种,目前尚无有效的治疗方法,患者通常经过多次鼻内镜鼻窦手术,但扔不能阻止鼻息肉复发,需要长期应用糖皮质激素以控制哮喘等症状,部分患者在接触阿司匹林后甚至出现危及生命的哮喘。在阿司匹林高敏反应的过程中,包括半胱氨酸白三烯(Cysteinyl leukotrienes, CysLTs)、类胰蛋白酶、ECP、前列腺素D2 (Prostaglandin D2, PGD2)在内的多种介质释放增多,而5-LO (Lipoxygenase,LO)、晦通路代谢异常,产生过量的CysLTs而诱发气管收缩、分泌增加及嗜酸性粒细胞(Eosinophil, EOS)浸润被认为是AERD的主要病理机制,但这并不能解释所有的现象,特别是在阿司匹林脱敏治疗过程中发现有相当一部分患者无法耐受脱敏治疗,而这部分患者血液中的PGD2含量显著高于耐受治疗者,并且这种PGD2的增高与患者气道阻塞的严重程度呈正相关,进一步提示了PGD2在AERD发病中的重要作用。作为花生四烯酸经COX代谢途径的重要产物,PGD2可以引起气管痉挛,血管扩张,EOS浸润,树突状细胞活化和迁移等多种作用,在AERD的发病中发挥了重要作用。现有的研究发现,AERD患者血液中PGD2及其代谢产物含量显著高于阿司匹林耐受性哮喘(Aspirin tolerant asthma, ATA)患者,而且在AERD患者服用阿司匹林后会进一步升高,但关于PGD2来源的问题却存在较大争议,传统的观念一直认为肥大细胞是PGD2的主要来源,因为促进PGD2生成的前列腺素合成酶(hematopoietic prostaglandin D2 synthase, hPGDS),过去仅在肥大细胞中被检测到。但近年来随着抗体特异性、敏感性的提高及检测技术的进步,某些EOS中也检测到了hPGDS的表达,但关于AERD患者的EOS是否能表达hPGDS并进一步合成释放具有生物活性的PGD2及其相关调控机制等问题,至今仍无相关研究。研究目的本研究的目的是通过对AERD患者鼻息肉及外周血EOS合成、释放PGD2及其相关机制的研究,明确EOS在AERD患者PGD2释放中的作用及相关调控机制,进一步揭示AERD的病理生理过程及发病机制,并为该病的靶向干预提供理论基础。研究方法和结果1、鼻息肉及鼻窦粘膜中hPGDS在mRNA水平的差异表达hPGDS是PGD2合成的限速酶,可以促进PGH2向PGD2转化,我们通过qPCR对9例AERD、17例CHES患者的鼻息肉及9例对照组鼻窦粘膜hPGDS在mnRNA水平的表达进行了检测,结果显示AERD患者鼻息肉中hPGDS在转录水平的表达要显著高于其它两组(p<0.05)。2、 鼻息肉及鼻窦粘膜的hPGDS免疫荧光染色为了明确鼻息肉及鼻窦粘膜组织中hPGDS在蛋白水平的表达及其细胞来源,我们对AERD、慢性增生性嗜酸性粒细胞性鼻窦炎(Chronic hyperplastic eosinophilic sinusitis,CHES)的鼻息肉及对照组鼻窦粘膜进行了hPGDS的免疫荧光染色。结果显示对照组鼻窦粘膜中几乎没有hPGDS阳性染色；CHES鼻息肉中检测到了中等程度表达的hPGDS阳性染色；而高强度的hPGDS染色几乎都出现在了AERD患者的鼻息肉中。且阳性细胞绝大多数来源于双叶核的EOS。我们进一步分析并计算了阳性EOS占总EOS的比例,显示AERD组显著高于CHES (p<0.05)及对照组(p<0.05),表明AERD患者的单个EOS有更强的hPGDS表达能力；而计算阳性EOS占总阳性细胞的比例显示AERD组显著高于CHES (p<0.05)及对照组(p<0.01),这表明AERD中的EOS对于阳性染色的贡献显著高于其它两组,反映了EOS在AERD患者hPGDS表达中发挥了更为重要的作用,是hPGDS的重要甚至是主要来源。3、外周血纯化嗜酸性粒细胞hPGDS的表达前期的实验中我们成功证实了AERD患者的鼻息肉在mRNA及蛋白水平均高表达hPGDS,并且免疫荧光的结果显示这种高表达较多的来源于EOS,因此我们进一步分离纯化了人外周血EOS,并对其hPGDS表达情况进行检测。qPCR检测结果显示AERD患者外周血纯化EOS的hPGDS在mRNA水平的表达要显著高于哮喘组及对照组(p<0.05)；Western Blot法检测的结果表明AERD患者纯化EOS的hPGDS在蛋白水平的表达量要显著高于对照组(p=0.01)及哮喘组患者(p<0.05)。这直接证明了AERD患者EOS在mRNA及蛋白水平均具有更强的hPGDS合成能力,同时也表明了除去组织内的高表达外,AERD患者外周血EOS的hPGDS也是高表达的。4、嗜酸性粒细胞PGD2释放的检测及阿司匹林刺激实验前面的研究证实了EOS在mRNA和蛋白水平可以成功的表达hPGDS,并且AERD患者的EOS是高表达的,表明其具备了PGD2的合成能力,但这种高表达并不一定意味着EOS可以合成并释放具有生物活性的PGD2。因此,为了验证EOS是否能合成并释放PGD2,我们通过EIA法直接测定了纯化EOS释放的PGD2。并进一步检测了LysASA刺激对PGD2释放量的影响。结果显示,所有EOS均检测到了PGD2释放,同时,随着LysASA的刺激浓度增加,PGD2的释放量也逐步增加,表明了LysASA可以促进EOS释放PGD2。进一步的分析表明,无论是在刺激前还是刺激后,AERD组的EOS,其上清液PGD2含量均高于哮喘组及对照组。5、IFN-γ对嗜酸性粒细胞表达hPGDS及合成PGD2影响的研究上面的研究表明AERD患者的EOS高表达hPGDS并具有更强的PGD2分泌能力,为了进一步研究其高表达hPGDS及释放PGD2的机制。我们首先通过IFN-γ、IL5、IL4、IL13刺激纯化的健康人外周血EOS,然后通过qPCR检测其hPGDS表达量的变化,结果显示各种因子刺激前后,hPGDS的表达没有显著的变化,表明细胞因子对已经分化成熟的EOS调节能力较弱。我们进一步将研究的重点转向由CD34+造血干细胞分化成熟的EOS,在IFN-y及非IFN-y环境中将健康人纯化CD34+造血干细胞诱导分化为成熟的EOS,进一步通过qPCR检测成熟后EOS的hPGDS的表达,结果显示IFN-y环境中成熟的EOS的hPGDS表达显著升高。而进一步通过EIA检测其上清液中PGD2的含量,显示IFN-y组上清液中PGD2的含量显著高于非IFN-y组,并且在LysASA刺激后显示了更强的PGD2释放能力。结论1. AERD患者鼻息肉中hPGDS在mRNA及蛋白水平高表达,AERD患者鼻息肉嗜酸性粒细胞表达了更高的hPGDS,并且相比肥大细胞,这种表达更加广泛,嗜酸性粒细胞在其中起了更为重要的作用。2. AERD外周血纯化的嗜酸性粒细胞高表达hPGDS,并且可以进一步合成释放PGD2。3.阿司匹林能够刺激嗜酸性粒细胞释放PGD2,AERD患者的嗜酸性粒细胞能够释放更多PGD2,并且对阿司匹林的刺激更敏感,这可能是AERD患者血液中PGD2升高及阿司匹林刺激后出现急性呼吸系统反应的原因。4.在IFN-y环境下由CD34+造血干细胞分化成熟的嗜酸性粒细胞高表达hPGDS,能够合成和释放更多的PGD2,并且对阿司匹林的刺激更敏感,鼻息肉中高IFN-y环境可能是AERD发病的原因。5.针对IFN-y环境下嗜酸性粒细胞分化成熟及PGD2合成通路的靶向干预可作为AERD治疗研究的新选择。