膝关节的正常功能取决于光滑的膝关节表面和较低的摩擦指数。这样的表面是由关节软骨提供的。虽然关节软骨是新陈代谢活跃的组织，但它缺乏支持修复和重建的血液供应。因此，关节软骨的轻微损伤可能导致渐进性损伤，并可能导致骨关节炎的发生。　　组织工程是一个跨学科的领域，应用工程学和生命科学的原理，它是利用生物替代品也就是材料支架来促进组织或器官的修复或再生。其基本过程是利用种子细胞和材料支架以及生物活性制剂制造新的有功能的组织来取代受损的器官或者组织。骨髓间充质干细胞具有组织工程研究所要求的特征，骨髓间充质干细胞可以进行广泛的复制而不向其他组织细胞分化，但是它们在一定条件下也具有多向分化潜能，不仅能向骨细胞分化，而且还可以向软骨和肌肉组织细胞等分化。羟基磷灰石(HA)在临床上应用广泛，具有较强的成骨性。然而，HA的吸收速率较低，而这一低速率可能会干扰体内的伤口愈合。聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)由于其较好的生物降解性和生物相容性，也被用作骨组织工程的支架。然而，PLGA的疏水表面对细胞的附着和增殖是不利的，因此，HA与PLGA结合后，维持了HA和PLGA的优点，在利用纳米技术，从而结合产生了纳米PLGA/HA复合材料。PLGA在HA中起到粘结剂的作用，降低了脆性，控制了复合材料特别是纳米材料的吸收比。　　本文根据组织工程的原理，利用纳米PLGA/HA复合材料和大鼠骨髓间充质干细胞来修复大鼠软骨缺损，取得了较好的效果。　　目的：　　应用纳米PLGA/HA复合物和大鼠骨髓间充质干细胞来修复大鼠股骨远端的软骨缺损。　　方法：　　1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离　　大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)从8周大的雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓中获得。用含有10％胎牛血清的DMEM-LG冲洗髓管收集骨髓细胞。用吸管将细胞悬液吹打均匀，然后将悬液用吸管贴壁轻轻加入到含预置等体积的Percoll分离液(1.073g/mL)离心管中，使之悬于上层，放于离心机中离心(2500r/min，30min)，收集单核细胞层进行培养。　　2、大鼠骨髓间充质干细胞的培养和观察　　干细胞培养在补充有10％胎牛血清的培养基的培养瓶中，并保持在温度37℃、5％的二氧化碳和95％的空气的环境中，经过15天的原代培养，当细胞达到了几乎完全融合，细胞进行传代为后续实验做准备。在培养期间，在相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞，记录生长过程。　　3、在PLGA/HA复合材料上的干细胞培养。　　纳米PLGA/HA复合物被切成1厘米×1厘米的小块，放入经环氧乙烷灭菌后24孔板，并在其上培养骨髓间充质干细胞，在扫描电镜(SEM)下观察了在24孔板上培养的干细胞的形态，扫描电镜可使细胞与复合材料之间的相互关系看的更清晰。同时观察没有培养细胞的PLGA/HA复合材料，了解其结构。　　4、动物实验　　所有20只大鼠均接受双侧后肢膝关节手术，在每只大鼠的股骨远端制造软骨缺损。用2％戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔麻醉，用1.5毫米直径牙科电钻在大鼠股骨远端创建一个全层关节软骨缺损，深达软骨下骨，每只大鼠左侧股骨远端软骨缺损处填充培养有MSC的PLGA/HA复合物，作为实验组(n=20)。右侧股骨软骨缺损不填充任何材料，;作为对照组(n=20)。术后2、4、8、12周进行大体观察和组织病理学评价。　　5、组织学评价　　在第2周处死两只大鼠做大体形态观察。在术后第4、8、12周分别处死6只大鼠，均进行安乐死，获取标本进行常规HE染色和甲苯胺蓝染色。术后12周，部分切片进行Masson三色染色。使用抗胶原蛋白Ⅱ型抗体检测Ⅱ型胶原蛋白的表达，进行免疫组化评价。所有组织学切片都在显微镜下观察。采用半定量的组织形态学分析方法，根据修正的Odriscoll评分量表，对组织切片进行修复评分。　　6、统计学分析　　根据组织学评分结果得分，通过配对t检验进行统计分析，比较对照组和实验组的评分结果差异，p值小于0.05具有统计学意义。　　结果：　　1、MSC的形态学　　从大鼠骨髓中分离出的MSCs在24小时后附着在培养皿表面，3到4天内呈现出星形或三角形的形状，3天后，培养基培养液中仍有大量的细胞悬浮，更换培养基时这些悬浮细胞被移除。一开始散在的贴壁细胞逐渐聚集在一起，7天后形成细胞簇落。10天后，细胞呈漩涡形或者螺旋形生长，呈现出MSCs的特征。　　2、电镜下材料复合物和MSC的形态　　纳米PLGA/HA复合材料具有纤维样结构，在SEM下显示出高度的多孔网状结构。这种孔隙度为MSCs生长提供了一个非常适合的生物相容环境，在该环境中，干细胞在复合材料表面生长扩散的非常良好。因此，可以证实纳米PLGA/HA复合材料具有良好的生物相容性，利于MSC的生长。　　3、股骨软骨缺损的外观观察　　4周后对照组的缺损区域在底部的有很少的新生组织生成，术后8周后有一一定的损伤修复，但是修复区域非常粗糙、不平整，看上去像是瘢痕组织。术后12周后修复组织和正常软骨之间仍有明显的边界，表面比较粗糙，并且没有完全修复。　　在实验组中，缺损区域在4周后被一层透明的脂肪样组织包裹，与周围组织良好的融合。术后8周，缺损区域的面积逐渐减少，表面光滑，已经接近修复。术后12周，实验组的原始缺损区域呈现出白色、光滑的表面，并与周围正常软骨完美地结合在一起，表面形成一层新生的软骨组织。　　4、HE染色结果　　实验组术后4周HE染色显示，该缺损区域内充满了复合材料，与周围基质结合，并在复合材料上生长出一层新生的未成熟的软骨细胞。新生软骨和正常软骨之间的边界非常清楚。新生软骨组织的HE染色比相邻的正常软骨要淡。复合材料内被小细胞填充，并由软骨下基质浸润。复合材料与周围组织结合良好，部分已开始降解。　　实验组术后8周HE染色显示，新生软骨几乎修复了缺损区。新生的未成熟软骨细胞逐渐发育成成熟的软骨细胞。　　术后12周，新生软骨组织基本修复了缺损区，并显示与周围关节软骨完全融合的光滑表面。新生软骨的HE染色与正常软骨相同。复合材料仍可以观察到，被包埋在软骨下骨，复合材料的周围组织仍可与正常软骨下骨区分，还可以看到一些复合材料降解的碎片。采用MSCs的PLGA/HA复合材料修复了原缺损区域。　　与实验组的修复组织不同，控制组大多数再生组织为纤维组织，控制组中没有新生的软骨组织。缺损区域充满新生纤维瘢痕组织。再生组织与邻近组织不同，表面粗糙。正常软骨和新生纤维组织之间有明显的界限。　　5、甲苯胺蓝染色　　甲苯胺蓝染色主要用于显示新生软骨组织内的酸性粘多糖等成分。术后4周，新生软骨基质被染色成浅紫蓝色，属于未成熟新生软骨基质，与正常软骨组织之间的边界非常清楚。术后12周新生软骨组织与周围正常软骨组织一样，被染成蓝紫色，说明基质内酸性粘多糖成分，特别是硫酸软骨素的存在。　　6、Masson三色染色　　Masson三色染色是软骨基质的特异性染色剂。胶原纤维被马森三色染色染成绿色或蓝色，用来区分胶原纤维和肌纤维。新生软骨基质在术后12周Masson三色染色阳性，证明新生软骨基质存在胶原纤维。　　7、免疫组化染色　　免疫组化评价主要是检测胶原蛋白Ⅱ型表达。免疫组织化学染色显示胶原蛋白Ⅱ型的阳性表达，不仅在新生软骨组织中形成，而且在12周后也出现在复合物中，还观察到软骨缺损区完全修复并与正常组织完全融合。　　8、组织学评分　　采用改进的ODriscoll分级量表对组织学结果进行半定量分析。在12周时评估两组组织修复的情况，对两组组织学得分进行配对t检验，实验组得分明显高于控制组(P＜0.01)，差异有统计学意义。　　结论：　　纳米相PLGA/HA复合材料具有高孔隙率的纤维结构，可作为一种适用于修复软骨缺损的组织工程支架。纳米PLGA/HA复合材料与MSCs结合成功修复了大鼠股骨远端软骨缺损，新生组织经HE染色、甲苯胺蓝染色、Masson三色染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色等，证实符合软骨组织成分，实验取得了满意效果，为软骨缺损的组织工程修复，提供了良好的动物实验基础。