帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是锥体外系功能紊乱引起的一种慢性中枢神经系统疾病，临床表现为运动徐缓、静止震颤、肌僵直以及平衡功能失调等症状，病情慢性进行性加重，晚期往往全身僵硬，生活不能自理，严重影响老年人的身心健康和生活质量。目前PD的病因未明，其典型的病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元变性，纹状体多巴胺（dopamine，DA）含量显著降低。根据DA缺失学说，目前临床主要应用L-DOPA替代治疗或DA受体激动剂改善PD症状。但这类药物并不能阻止疾病的进展，且DA受体激动剂长期使用疗效欠佳，L-DOPA易出现随意运动障碍、诱发心脏病等许多严重的不良反应。因此，加强PD的病因学研究、发现研发治疗PD新药的有效靶标，对于提高人类健康水平具有重大意义。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel，K_ATP)是一种耦联细胞电活动和代谢、以细胞内的ATP／ADP水平为门控因素、非电压依赖性的特殊钾离子通道。近年来，包括本实验室在内的研究已经表明：1) K_ATP激活不仅是脑神经元在急性缺血缺氧、氧化应激等病理因素所致损伤时的重要内源性保护机制，而且在神经元受损中、后期的神经炎性病理反应以及神经元凋亡进程中也发挥重要的保护作用；2) K_ATP与PD的发生、发展密切相关，是研究PD的病因学和研发治疗药物的新靶标。根据上述学术研究成果，我们以K_ATP为靶标，自行设计、合成了脂肪仲胺类小分子化合物埃他卡林（iptakalim，IPT），包括电生理学、药理学研究和受体结合试验在内的系列研究工作已确认其为新型K_ATP开放剂。本实验室前期研究发现IPT不仅可以透过血脑屏障，而且在不扩张血管和降低血压的剂量时，即可对急慢性脑缺血损伤产生确切的神经保护作用。本文旨在研究埃他卡林对PD模型大鼠的实验治疗作用及其机制，为将IPT发展成为PD治疗新药积累必要的学术与实验基础。本文工作第一部分应用rotenone和6-OHDA作为PD致模毒素，研究IPT对大鼠行为学及中枢DA、Glu等递质含量的影响，旨在探索IPT对神经退行性疾病的治疗潜值；第二部分研究IPT对Glu诱导的PC12细胞损伤的保护作用，探讨IPT神经保护作用的突触后机制；研究IPT对PC12细胞释放Glu的影响，探讨IPT神经保护的突触前机制；第三部分研究IPT对帕金森病模型大鼠突触体及原代星形胶质细胞重摄取Glu的调节作用，探讨IPT间接的神经保护作用。第一部分埃他卡林对PD模型鼠的保护作用及对纹状体细胞外谷氨酸水平的影响目的：研究IPT对rotenone和6-OHDA诱导的大鼠行为学和神经化学改变的影响及相关机制。方法：1) SD大鼠给予IPT(1.5 mg·kg^-1·day^-1)或mito-K_ATP开放剂二氮嗪(diazoxide，1.5 mg·kg^-1·day^-1)连续灌胃三天，自第四天起，于每天IPT或diazoxide灌胃后1 h背部皮下注射rotenone(2.5mg·kg^-1·day^-1)，连续给药4周，统计各组大鼠死亡率并进行行为学研究；2)6-OHDA制备PD模型大鼠：SD大鼠右侧黑质立体定位注射6-OHDA8μg／μL，饲养21天后，皮下给予Apomorphine(0.05 mg·kg^-1)诱导旋转行为，筛选成功的PD大鼠模型；2)成功PD模型大鼠分为5组进行给药治疗：IPT治疗组(0.75 mg·kg^-1·day^-1，1.5 mg·kg^-1·day^-1，3.0mg·kg^-1·day^-1)，每天一次，连续灌胃21天；L-DOPA治疗组(10mg·kg^-1·day^-1)，每天一次，连续灌胃21天；模型组以及正常对照组每天灌胃生理盐水，连续21天；3)在给药治疗第7、14及21天，各组大鼠均进行Apomorpmne诱导的旋转实验，进行行为学检测；4)治疗结束后，各组大鼠进行立体定位手术在大鼠双侧纹状体埋置套管，恢复6天后进行微透析实验，收集生物样品进行HPLC检测微透析液中的神经递质水平。5)多聚甲醛灌注，脑冰冻切片行免疫组织化学研究。结果：1)单独给予rotenone(2.5 mg·kg^-1·day^-1)皮下注射4周，大鼠的死亡率为51％，前爪移动潜伏期均值为28 s，提示大鼠出现明显的肌僵直症状；黑质和纹状体DA含量较溶剂对照组大鼠显著降低；IPT或选择性mito-K_ATP开放剂diazoxide均可显著降低大鼠的死亡率，缓解大鼠肌僵直症状，增加大鼠黑质和纹状体DA的含量。给予不同浓度的IPT、diazoxide或L-DOPA治疗两周，可以显著改善大鼠肌僵直症状；不同程度的提高黑质和纹状体DA的含量；IPT和diazoxide的上述作用均可被mito-K_ATP阻断剂5-HD所拮抗。2) IPT治疗组(1.5 mg·kg^-1·day^-1，3.0 mg·kg^-1·day^-1)在降低健侧纹状体细胞外DA水平的同时，能够增加患侧纹状体DA水平；L-DOPA治疗组和IPT治疗组(0.75 mg·kg^-1·day^-1，1.5 mg·kg^-1·day^-1，3.0 mg·kg^-1·day^-1)对PD模型大鼠健侧纹状体细胞外Glu水平没有影响，但是均可以显著降低患侧纹状体的细胞外Glu水平。3)免疫组化研究发现，模型组大鼠毁损侧SN的TH阳性细胞数较健侧及伪手术组大鼠显著减少，IPT治疗组大鼠的毁损侧、健侧与模型组大鼠黑质TH阳性细胞计数没有显著性差异；模型组大鼠毁损侧SN的GFAP阳性细胞数较健侧及伪手术组大鼠显著增加，IPT治疗组大鼠毁损侧较模型组GFAP阳性细胞数显著减少，而治疗组大鼠健侧的GFAP阳性细胞数较模型组及伪手术组大鼠健侧没有显著改变。结论：IPT能够增加rotenone和6-OHDA模型大鼠黑质和纹状体DA的含量，减少模型大鼠毁损侧纹状体细胞外Glu的含量，缓解rotenone诱导的大鼠帕金森样症状。其保护机制可能是通过开放KATP，减少突触前释放Glu，缓解Glu对突触后NMDA等受体的激动，以及抑制星形胶质细胞活化、增强其重摄取Glu能力，从多个途径降低Glu的兴奋性神经毒性作用。第二部分埃他卡林对PC12细胞释放谷氨酸的影响目的：研究IPT对PC12细胞释放Glu的影响，并探讨IPT对Glu诱导的细胞损伤的保护作用。方法：1)培养PC12细胞，提前15 min给予不同浓度的IPT或pinacidil，再加入10 mmol·L^-1 Glu孵育24 h，噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，Fluo-3 AM检测细胞内Ca²⁺浓度，流式细胞仪检测细胞凋亡；2) PC12细胞给予80 mmol／L KCl，HPLC-ECD检测细胞外Glu的浓度。结果：1) 10 mmol·L^-1 Glu可显著降低PC12细胞存活率（P＜0.01），预先给予10μmol·L^-1 IPT可以提高PC12细胞的存活率，抑制细胞凋亡，降低细胞内Ca²⁺浓度。上述作用均可以被K_ATP通道阻断剂glibenclamide取消。2)高钾可显著诱导PC12细胞释放谷氨酸，预先给予不同浓度的IPT均可以显著减少PC12细胞释放谷氨酸。结论：IPT对Glu导致的PC12细胞损伤有保护作用，同时，IPT可以抑制PC12细胞释放Glu。第三部分埃他卡林对PD模型鼠突触体及原代培养的大鼠星形胶质细胞谷氨酸摄取功能的影响目的：探索IPT对PD模型大鼠突触体及原代培养的大鼠星形胶质细胞Glu重摄取功能是否具有调节作用。方法：1)建立6-OHDA大鼠PD模型，制备皮层及纹状体突触体，使用液闪计数仪测定[³H]-D，L-Glutamate摄取量；2)取出新生1天SD大鼠的全脑，去除脑膜和血管，用0.25％胰蛋白酶消化成细胞悬液后，培养原代星形胶质细胞，同法检测[³H]-D，L-Glutamate摄取量。结果：10、50和100μmol·L^-1 IPT可显著改善患侧纹状体及皮层突触体的谷氨酸摄取功能。50μmol·L^-1 6-OHDA和150μmol·L^-1 MPP⁺均显著降低原代培养星形胶质细胞重摄取Glu的功能，IPT可以增强上述原代培养的星形胶质细胞重摄取Glu的能力，该作用可被K_ATP通道阻断剂glibenclamide取消。结论：IPT可以增强帕金森病模型大鼠突触体及原代培养的星形胶质细胞重摄取Glu的功能。综上所述，本研究工作的主要创新之处在于：1．首次从整体、细胞和分子水平系统研究具有自主知识产权、能透过血脑屏障的新型K_ATP开放剂IPT对PD模型鼠的实验治疗作用及其机制，研究成果为将IPT发展为治疗PD的创新药物积累了必要的学术与实验基础。2．首次证明K_ATP开放剂IPT的保护作用与其拮抗谷氨酸诱导的兴奋性神经毒性作用有关。3．首次在国际学术界报道开放星形胶质细胞K_ATP可以增强其重摄取Glu的功能，系统阐明了IPT对神经元和胶质细胞功能的调节作用及其神经保护机制，为诸多炎性相关的神经退行性疾病的治疗提供有益的思路。