农杆菌介导法将热激蛋白基因(hsp101)转入早熟禾

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草地早熟禾(Poa pratensis L.)属冷季型草坪草,是温带地区重要的草种之一。它具有色美、抗寒、耐荫、耐修剪等优点,在我国北方地区多被用于建造草坪。但草地早熟禾也有一些缺点,如易受病虫危害、不耐炎热、耐低温能力差、抗旱力不强等,这极大地限制了草地早熟禾在炎热地区的推广。由于草地早熟禾为兼性无融合生殖方式,采用常规育种方法培育早熟禾耐热新品种困难较大。因此,利用基因工程的手段来改良草地早熟禾的耐热性成为当务之急。现有的草地早熟禾遗传转化体系存在着植株再生困难、体细胞无性系变异发生频率高以及转化周期长、效率低等缺点,严重制约了早熟禾基因工程育种研究的发展。 本研究首先建立了草地早熟禾丛生芽离体培养体系。该体系是以草地早熟禾种子苗茎尖为外植体,切取茎尖(含胚轴和生长点)在附加0.5mg/L 2.4-D和3.0mg/L 6-BA的培养基上诱导基部膨大,切下膨大的基部转至附加2.0mg/L 6-BA的培养基上诱导产生丛生芽,然后将丛生芽转入附加3.0mg/L 6-BA和0.07mg/L2.4-D的培养基上继代培养,使丛生芽大量扩增。 以两个草地早熟禾栽培品种纳苏(Nassau)、Mardona的丛生芽芽尖为受体,通过农杆菌介导的方法将来源于玉米、编码热激蛋白101(HSP101)的hsp101基因导入草地早熟禾丛生芽块中。取继代培养5-7天的从生芽切至暴露出芽尖生长点,与农杆菌菌液浸染,同时在0.5MPa负压下处理5min,不吸去芽尖表面多余菌液,将芽尖转移到丛生芽诱导培养基上,黑暗条件下共培养3天,然后将芽尖转移到添加100mg/L头孢霉素的培养基上抑菌培养20天,再转移到加有6.0mg/L潮霉素的筛选培养基上连续筛选3代,每代10天。存活的抗性芽经增殖后,转入生根培养基,20天后移栽入花盆中。对转化植株进行PCR和PCR-Southern blotting分析表明外源基因hsp101已经转移到草地早熟禾细胞中。 研究了影响转化效率的因素,发现侵染时农杆菌菌液浓度、AS的诱导、真空渗入处理及处理时间均能影响转化率。适宜的转化参数为菌液浓度OD600=0.6、添加0.1mmol/L的AS、在负压0.5MPa下浸染5min。 对转基因株系进行的耐热性分析表明:转基因株系对高温胁迫的抗性与对照
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