草乌(AconitiKusnezoffi Radix.)是中药和蒙药最有常用的的药材之一。为了更全面的开发草乌的应用,一种传统的草乌炮制方法熏制的基础上开发了一种新的方法烘制方法,以降低生药的毒性。为了探究烘制减毒作用机制,本研究通过给Wistar大鼠灌胃21天生草乌、烘草乌和制草乌,采用肝脏、血清及尿液代谢组学方法探究生草乌、烘草乌和制草乌组大鼠内源性代谢物及代谢通路的影响,结合网络药理学方法探讨草乌治疗疼痛、风湿和炎症等症状疾病的“多成分-多靶点-多通路”的药效作用机制,试图从整体角度更全面的说明蒙药草乌的毒性和烘制减毒作用机制。目的:1.选出符合《中国药典》和地方标准且具有蒙医药代表性的蒙药草乌。2.通过做组织病理切片看生草乌、烘草乌、制草乌对各个组织的毒性。3.采集生草乌组、烘草乌组、制草乌组和空白对照组大鼠肝脏、尿液和血清样本做非靶标代谢组学测试,选出差异代谢物,定烘草乌组可能的生物标记物,并作相对含量分析。4.基于中药网络药理学分析平台筛选草乌的主要活性成分、作用靶点及相关疾病,采用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病直接作用网络。方法:1.先用HPLC法测定生草乌组、烘草乌组、制草乌组中乌头原碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头碱和苯甲酰新乌头碱等六种主要生物碱;2.再用40只雄性Wistar大鼠,随机分为4组,每组10只,即:空白对照组、生草乌组、烘草乌组、制草乌组。适应性喂养一周,再给药21天,观察实验过程中各组大鼠的体征变化及心、肝、脾、肺、肾、脊髓、脑神经、坐骨神经、胃等九个组织的病理变化;3.用40只雄性Wistar大鼠,随机分为4组,每组10只,即:空白对照组、生草乌组、烘草乌组、制草乌组。适应性喂养一周,再给药21天,采集生草乌组、烘草乌组、制草乌组和空白对照组大鼠尿液、血清和肝脏样本,运用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术进行非靶标代谢组学检测,采用Progenesis QI软件进行代谢组学数据预处理,利用MetaboAnalyst对预处理后的数据进行多元统计分析。筛选同时满足差异倍差异倍数(Foldchange,FC)≥1.2 或≤0.8,q-value<0.05 以及 OPLS-DA 模式下的VIP≥1.0的模型组不同造模阶段及空白对照组大鼠尿液、血清和肝脏的差异代谢物,通过检索HMDB等数据库、热图聚类分析及Venn图分析得到空白对照组对比生草乌组、烘草乌组、制草乌组的共有差异代谢物,将筛选的差异代谢物进行相关代谢通路及相对含量变化分析。对空白对照组、生草乌组、烘草乌组、制草乌组各组大鼠的尿液、血清及尿液样本进行代谢轮廓分析,从血清和肝脏差异代谢物中筛选制草乌治疗等疾病的差异代谢物及靶标代谢通路;4.基于中药网络药理学分析平台筛选草乌的主要活性成分、作用靶点及相关疾病,采用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病直接作用网络及STRING构建蛋白质与蛋白质相互作用网络,利用DAVID软件进行基因本体(GO)和作用通路(KEGG)富集分析。结果:1.根据HPLC法测定出的生草乌的双酯型乌头碱:3.2217mg·g-1单酯型乌头碱:0.4981mg·g-1、烘草乌组的双酯型乌头碱:0.3271 mg·g-1单酯型乌头碱:4.3883 mg·g-1、市售制草乌组的单酯型乌头碱:0.6046mg·g-1。均符合《中国药典》和地方标准。2.空白对照组、生草乌组、烘草乌组、制草乌组四组给药21天后取心、肝、脾、肺、肾、脊神经、脑组织、坐骨神经、胃等九个组织的病理变化;结果:脑组织、坐骨神经未发现病理变化;心脏、肝脏、肺脏、脾脏、胃、脊髓除了生草乌组的少数大鼠其他组未见病理变化;肾脏除了空白对照组,其他组的有些许病理变化。3.从肝脏、血清和尿液样本中共筛选得到33种潜在的代谢标志物(肝脏15种、血清9种、尿液9种)可能与烘草乌解毒和药效作用机制相关。经烘草乌组对比空白对照组后选了差异代谢物做相对含量分析,从肝脏中选出L-亮氨酸、乙酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-精氨酸、α-亚麻酸、牛磺胆酸、丙酮酸、苯二甲酸、丙酮醛、二氢尿嘧啶、岩藻糖1-磷酸、亚油酸、L-蛋氨酸、顺乌头酸等15个差异代谢物作为肝脏生物标志物;利用代谢组学数据归一化后的Mean值来表示对非靶标代谢组中筛选出的生物标记物相对含量的变化,与空白对照组相比,烘草乌组大鼠的L-精氨酸、α-亚麻酸、苯二甲酸、二氢尿嘧啶、亚油酸的相对含量显著上升(P<0.05),L-亮氨酸、乙酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、牛磺胆酸、丙酮酸、丙酮醛、岩藻糖1-磷酸、L-蛋氨酸、顺乌头酸的相对含量显著下将(P<0.05)。通过分析其相关代谢通路,结果显示涉及牛磺酸和低钙氨酸代谢,氮代谢,组氨酸代谢,酮体的合成与降解,α-亚麻酸代谢,缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成,核黄素代谢,半胱氨酸与蛋氨酸代谢,泛酸和辅酶A生物合成,丙酮酸代谢,亚油酸、维生素B6代谢,乙醛酸和二元酸代谢等13个代谢通路;从血清中选出L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、硬脂酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺、顺乌头酸、L-岩藻糖、山梨醇等9个差异代谢物作为血清生物标志物;利用代谢组学数据归一化后的Mean值来表示对非靶标代谢组中筛选出的生物标记物相对含量的变化,与空白对照组相比,烘草乌组大鼠的硬脂酸、L-谷氨酰胺、顺乌头酸、L-岩藻糖的相对含量显著上升(P<0.05),L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬酰胺、山梨醇的相对含量显著下将(P<0.05)。通过分析其相关代谢通路,结果显示烘草乌代谢涉及烟酸和烟酰胺代谢、脂肪酸生物合成、苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、组氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、果糖和甘露糖代谢,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、乙醛酸和二元酸代谢等13个代谢通路;从尿液中选出异烟酸、9-顺式视黄醇、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-缬氨酸、3-脱氢木素、2-脱氧肾上腺素、3-甲基硫丙酸、1-吡咯啉-2-羧酸、脱氧胞苷等9个差异代谢物作为尿液生物标志物;与空白对照组相比,烘草乌组大鼠的异烟酸、9-顺式视黄醇、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-缬氨酸、3-脱氢木素是上调(P<0.05),2-脱氧肾上腺素、3-甲基硫丙酸、1-吡咯啉-2-羧酸、脱氧胞苷是下调(P<0.05)。通过分析其相关代谢通路,结果显示涉及精氨酸和脯氨酸代谢、半胱氨酸与蛋氨酸代谢、组氨酸代谢、酪氨酸代谢等4个代谢通路;综合分析肝脏、血清和尿液相关的代谢通路表明烘草乌主要是通过调节机体内(肝脏13个、血清13个、尿液4个)共30个代谢路径进行解毒及发挥药效作用。4.草乌中有8个活性成分,作用靶点82个及相关疾病113种。“成分-靶点-疾病”网络分析显示草乌主要通过Izoteolin 活性成分,作用于 Prostaglandin G/H synthase 1,Muscarinic acetylcholine receptor M3,Muscarinic acetylcholine receptor M1,Androgen receptor,Sodium channel protein type 5 subunit alpha,Muscarinic acetylcholine receptor M5,Prostaglandin G/H synthase 2,Muscarinic acetylcholine receptor M4 Retinoic acid receptor RXR-alpha,Delta-type opioid receptor,Acetylcholinesterase,Alpha-1B adrenergic receptor,Sodium-dependent dopamine transporter,Beta-2 adrenergic receptor,Alpha-1D adrenergic receptor,Sodium-dependent serotonin transporter,Mu-type opioidreceptor,Alpha-1A adrenergic receptor等关键靶点发挥药效作用于多种疾病。GO注释和KEGG通路富集分析显示草乌通过调控 PTGS1,CHRM3,CHRM1,AR,SCN5A,PTGS2,RXRA,OPRD1,ACHE,ADRA1B,SLC6A3,ADRB2,ADRA1D,SLC6A4,OPRM1,ADRA1A等靶点起到了镇痛和止痛的作用。通过调节PTGS1,CHRM3,AR,PTGS2,OPRD1,SLC6A4,OPRM1等靶点作用于风湿病通路。通过调节PTGS1,CHRM3,CHRM1,AR,SCN5A,CHRM5,PTGS2,RXRA,OPRD1,ACHE,ADRA1B,SLC6A3,ADRB2,ADRA1D,SLC6A4,OPRM1,ADRA1A 等靶点作用于炎症通路。表明草乌可以通过“多成分-多靶点-多通路”的作用机制发挥药效起到治疗疾病的作用。结论:1.从内蒙古包头乌拉山采到了符合《中国药典》和地方标准的生草乌,通过烘制得到的烘草乌也符合《中国药典》和地方标准;2.在本实验剂量范围内,生草乌组、烘草乌组、制草乌组大鼠给药21天后,三种药对脑组织、坐骨神经未发现损伤,对肾脏有轻微毒性;生草乌对心脏、肝脏、肺脏、脾脏、胃、脊髓有一定毒性;3.从烘草乌组肝脏、血清和尿液样本中共筛选得到33种潜在的代谢标志物(肝脏15种、血清9种、尿液9种)可能与烘草乌减毒和药效作用机制相关。肝脏、血清和尿液相关的代谢通路表明烘草乌主要是通过调节机体内(肝脏13个、血清13个、尿液4个)共30个代谢路径进行解毒及发挥药效作用;4.草乌通过调控CACNA1A、CHRM2、CHRM4、CNR1、KCNJ10、PTGS2、SCN11A、SCN5A 和 TACR2 等靶点起到了镇痛、抗炎、抗风湿作用。为揭示草乌“多成分-多靶点-多通路”相互关联的生物效应机制奠定理论基础。