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人体中最主要的清除超氧阴离子自由基的物质就是超氧化物歧化酶(SOD),它有三种亚型,其中胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)含量最少。目前对重组EC-SOD蛋白的发酵工艺研究较少,重组蛋白表达量也很低。本研究工作目标是通过毕赤酵母表达重组EC-SOD,优化发酵工艺条件,以获得重组蛋白高回收率。具体内容包括单因素实验、响应面优化YPD培养基配方、正交实验、5L发酵罐预试验等。通过免疫印迹实验结果,确定毕赤酵母成功表达重组目标蛋白EC-SOD,分子量15kDa。比较YPD培养基与BMMY/BMGY培养基的胞外表达EC-SOD能力,发现二者在目标蛋白表达量上无显著性差异,故选用成本较低的YPD培养基。发酵条件具体优化如下:发酵温度30℃,接种量2%,初始pH值为6,甲醇诱导浓度2%,培养36 h后诱导,180 rpm,装液量10%,不加碳源等条件分别在每组中酶活力最高。利用Design-Expert设计响应面优化实验,优化后配方为:酵母抽提液15 g/L,蛋白胨25 g/L,发酵参数优化后的最佳蛋白表达水平,以SOD酶活力计为200.8 U/mL,相较优化前酶活力提高了约6.4倍。利用SPSS设计五因素三水平的正交试验,结果EC-SOD的胞外表达最优条件为,初始pH值为6,接种24 h后甲醇诱导浓度2%,30℃,180rpm培养,SOD酶活力为235.7U/mL,较优化前提高约7.7倍。EC-SOD的5 L罐发酵实验参数,种龄24 h,接种量10%,氨水调pH 6培养,50%的甘油流加补料,50%的甲醇流加诱导,溶氧量保持20%,根据溶氧反馈调节转速和流加速度。相比FM22培养基,YPG培养基5 L发酵缩短了菌体延滞期,酶活力提高约79.3%。此外,本研究还利用毕赤酵母表达环状排列黄色荧光蛋白(cpYFP),该蛋白是特异性荧光探针,并有专一性强,实时、定量、可视等优点。cpYFP的单因素发酵工艺优化的结果表明:最佳发酵温度26 ℃,初始pH值为7,2%接种量,1.5%的甲醇诱导浓度,选用FM22培养基等更有利于目标蛋白表达。cpYFP的5L发酵预实验参数,接种量10%,温度为26℃ 氨水调pH为7,50%甘油流加补料,50%甲醇流加诱导,溶氧保持20%,溶氧反馈调节转速与流加速度。5 L发酵预实验进一步提高了 cpYFP的表达量。