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背景黄芪甲苷作为传统中药黄芪的主要有效成分之一,是一种羊毛酯醇型的四环三萜皂苷,分子式为C14H68O14,它具有多重的药理学作用,包括抗炎、抗病毒、抗凋亡等。黄芪甲苷通过调节能量代谢机制可以减轻缺血再灌注性心肌损伤,通过抑制氧化应激可以预防急性肾损伤,保护氧化应激诱导的心肌细胞损伤等。这些研究提示黄芪甲苷具有抗氧化功能,它的作用机制尚不清楚。线粒体是细胞内主要能量形式-ATP产生的细胞器,参与细胞内一系列的能量代谢过程,同时线粒体也是细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生的主要细胞器。生理条件下产生的ROS在调节细胞的分化、自我吞噬、代谢适应和免疫细胞的激活等方面充当重要的角色。的确,目前线粒体被认为是接收、整合、传递生物分子信号的主要细胞器之一,在细胞应对环境不同刺激方面充当重要角色。所以,线粒体的功能紊乱可能会导致不同器官组织的功能损害。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统的一个主要的生理活性物质,在病理状态下其参与到心血管疾病的发生发展过程。血管紧张素Ⅱ引起的线粒体功能紊乱参与到高血压、动脉粥样硬化、心力衰竭、血管介入后再狭窄等心血管性疾病的发生发展过程。在血管紧张素Ⅱ的刺激下,平滑肌细胞发生了增殖、肥大、迁移、凋亡和自分泌功能的紊乱,这一系列事件导致了血管功能失调和疾病的发生。本实验室前期研究发现,黄芪甲苷可以改善肾性高血压大鼠血管壁顺应性和降低血压。然而黄芪甲苷对于血管紧张素Ⅱ诱导的主动脉平滑肌细胞线粒体功能障碍的保护作用还不明确,有待于进一步研究。目的研究黄芪甲苷对血管紧张素Ⅱ引起线粒体功能紊乱的保护作用及其可能的作用机制。方法1.主动脉平滑肌细胞的培养采用雄性SD大鼠(180-220 g)主动脉外植体贴壁培养法进行平滑肌细胞的培养。第4代的细胞通过形态学观察结合抗α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体免疫细胞化学方法进行平滑肌细胞的鉴定。本实验所用的细胞是第4至6代内的SD大鼠主动脉平滑肌细胞。2.黄芪甲苷干预液的制备及细胞毒理学试验黄芪甲苷是难溶于水的中药,通过溶解在羟丙基-p-环糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, HPBCD)中来准备储备液,以后用DMEM培养基将其稀释成50、150μg／mL的浓度来准备工作液。HPBCD及黄芪甲苷对于主动脉平滑肌细胞的毒理学试验通过与主动动脉平滑肌细胞共孵育24小时,检测孵育液上清中的乳酸脱氢酶(LDH)及细胞活力实验(MTT实验)来验证。3.血管紧张素Ⅱ干预浓度的选择用DMEM培养基将血管紧张素Ⅱ按照不同的浓度梯度(0.01至10 μM)进行稀释后与平滑肌细胞共孵育24小时,通过MTT实验检测细胞的活力进行最佳干预浓度的筛选。结果1 μM的血管紧张素Ⅱ被选择应用于下面的实验。4.建立损伤／保护模型将主动脉平滑肌细胞以3000个细胞／孔的密度接种至96孔板,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养10个小时左右,待细胞完全贴壁后,弃去培养液,改用无血清的DMEM培养基饥饿处理24小时,弃去培养基,设置对照组,Ang Ⅱ (1μM), Ang Ⅱ(1μM)+黄芪甲苷(5、50、150μg/mL)和AngⅡ(1μM)+洛沙坦(10 μM)处理组进行干预24小时后,通过MTT实验来验证血管紧张素Ⅱ和黄芪甲苷对于平滑肌细胞活力的影响。下面的所有实验分组情况：对照组、Ang Ⅱ (1μM)处理组、Ang Ⅱ (1μM)+As-Ⅳ (50μg/mL)干预组和Ang Ⅱ (1μM)+As-Ⅳ (150μg/mL)干预组。5.评价黄芪甲苷对于血管紧张素Ⅱ引起线粒体功能紊乱的保护作用1)透射电镜观察线粒体形态改变；2)应用JC-1荧光染料预染细胞,荧光显微镜下观察线粒体膜电位；3)生物发光法检测细胞线粒体ATP含量；4)应用DCFDA荧光染料预染细胞,流式细胞仪检测细胞活性氧；5)实时荧光定量PCR法检测线粒体DNA (mtDNA)拷贝数。6.黄芪甲苷对于血管紧张素Ⅱ引起平滑肌细胞线粒体功能紊乱保护作用的机制研究1) NADPH氧化酶活性比色法定量检测平滑肌细胞内NADPH氧化酶活性；2)黄嘌呤氧化酶检测试剂盒检测平滑肌细胞内黄嘌呤氧化酶活性；3)超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒检测平滑肌细胞内总的超氧化物歧化酶(Total SOD)和锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活性；4) Real-time PCR检测线粒体生物合成PGC-1α-NRF1-Tfam通路mRNA表达,western blot检测PGC-1α蛋白表达。结果1.采用MTT法和细胞孵育液上清中乳酸脱氢酶(LDH)检测来验证黄芪甲苷(As-Ⅳ)对主动脉平滑肌细胞活力及损伤的影响,结果证实：小于150μg/mL As-Ⅳ与主动脉平滑肌细胞共孵育24小时对平滑肌细胞的活力及损伤没有明显的影响；2.通过透射电镜观察,Ang Ⅱ(1μM)干预的平滑肌细胞线粒体的数量减少,线粒体嵴减少、断裂、消失,部分线粒体发生肿胀,甚至呈现空泡状。AngⅡ+As-Ⅳ(150μg/mL)处理与Ang Ⅱ单独干预相比,明显减缓了Ang Ⅱ引起的线粒体损伤改变；3.血管紧张素Ⅱ及黄芪甲苷对SD大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体膜电位及ATP的影响：与对照组比较,Ang Ⅱ干预的平滑肌细胞线粒体膜电位的平均水平显著下降(53% vs 100%),ATP的生成明显降低(7.4 vs 13.5 nmol/mg protein)。Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL)和Ang Ⅱ+As-Ⅳ(150μg/mL)处理组与单独Ang Ⅱ干预组比较,显著抑制了线粒体膜电位的降低(72% Vs53%, 88 %vs 53%),且增加了ATP的生成(10.2 vs 7.4,11.2 vs 7.4nmol/mg protein)并呈现剂量依赖性；4.血管紧张素Ⅱ及黄芪甲苷对SD大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体DNA (mtDNA)拷贝数的影响：与对照组比较,Ang Ⅱ(1μM)减少了主动脉平滑肌细胞ntDNA的拷贝数(85% vs 100%)。Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL) 和Ang Ⅱ+As-Ⅳ(150μg/mL)干预组与单独Ang Ⅱ处理组比较,显著增加了mtDNA的拷贝数(93.6% vs 85%,96.8% vs 85%),呈现出剂量依赖性；5.血管紧张素Ⅱ及黄芪甲苷对SD大鼠主动脉平滑肌细胞内活性氧(ROS)的影响：与对照组比较,Ang Ⅱ(1μM)的干预增加了平滑肌细胞内ROS的产生(180% vs 100%),而Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL)和Ang Ⅱ+As-Ⅳ(150 μg/mL)处理组与单独Ang Ⅱ干预组比较,显著抑制了细胞内ROS的产生(140%vs 180%,125%vs 180%),并且呈现出剂量依赖性作用；6. 主动脉平滑肌细胞ROS生成与清除相关酶活性检测：与对照组比较,Ang Ⅱ(1μM)引起了平滑肌细胞内NADPH氧化酶和黄嘌呤氧化酶活性显著升高(262% vs 100%,12.4 vs 8.0U/g protein),而Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL) 和Ang Ⅱ+As-Ⅳ(150μg/mL)干预组与单独Ang Ⅱ处理组相比,显著抑制了Ang Ⅱ诱导的NADPH氧化酶活性的升高(180% vs 262%,149% vs262%),同时也抑制了黄嘌呤氧化酶活性的升高(10.0 vs 12.4,8.9 vs 12.4 U/g protein),并呈现出剂量依赖性。此外,与对照组比较,Ang Ⅱ(1μM)显著抑制了平滑肌细胞内总S OD和Mn-SOD的活性(50%vs 100%,68%vs100%),而Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL)和Ang Ⅱ+As-Ⅳ(150μg/mL)处理组与单独Ang Ⅱ干预组比较,显著增强了平滑肌细胞内总SOD的活性(71.2%vs 50%和81%vs 50%)及Mn-SOD的活性(84%vs 68%,91%vs68%),并呈现出剂量依赖性；7.线粒体生物合成通路相关基因及蛋白的检测：与对照组比较,Ang Ⅱ(1μM)显著抑制了PGC-1α, NRF-1, Tfam基因mRNA的表达(抑制率分别为24%,26%,15%)。Ang Ⅱ+As-Ⅳ (50μg/m L)处理组增强了单独Ang Ⅱ干预平滑肌细胞PGC-1α, NRF-1, Tfam基因的mRNA的表达(分别增加了27%,42%,14%), Ang Ⅱ+As-Ⅳ (150μg/mL)处理组增强了单独Ang Ⅱ干预平滑肌细胞PGC-1α, NRF-1, Tfam基因的mRNA的表达(分别增加了45%,55%,24%)。与对照组比较,Ang Ⅱ (1μM)明显抑制了PGC-1 α的蛋白表达(抑制率为22%),而Ang Ⅱ+As-Ⅳ(50μg/mL)和Ang Ⅱ+As-Ⅳ (150μg/mL)处理组与单独Ang Ⅱ干预组比较增加了PGC-1α的蛋白表达(分别增加了21%,28%)。结论黄芪甲苷减缓了血管紧张素Ⅱ引起的SD大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体损伤。降低ROS生成酶活性,增强ROS清除酶活性以及激活线粒体生物合成通路的途径,是黄芪甲苷对血管紧张素Ⅱ引起SD大鼠主动脉平滑肌细胞线粒体损伤的保护作用途径之一。