黄曲霉毒素(Aflatoxm)是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)生长繁殖过程中产生的一类有毒的次生代谢产物。黄曲霉毒素(AFT)是迄今毒性最强的一类生物毒素之一,具有致畸、致癌和致诱变作用,对人和动物具有强烈的毒性。花生是最容易感染黄曲霉毒素的作物之一。减少或降低花生等农作物黄曲霉毒素污染的途径或方法有许多,其中生物防治是最有效、最经济的途径之一。　　 本论文从位于广东汕头市的一块花生田中鉴定分离出一个能很强抑制黄曲霉菌生长和产毒的拮抗菌株,通过形态观察,18S rDNA序列测定等方法对该菌株进行分类鉴定,并试图从其分泌蛋白中筛选鉴定出抗黄曲霉相关蛋白质,以期为下一步发展花生黄曲霉生物防治技术打下基础。实验结果表明:　　 1.抑菌实验分离鉴定拮抗菌株的发酵液对黄曲霉菌丝生长和孢子萌发有显著抑制作用,且能抑制毒素的产生并降解黄曲霉毒素B1；田间试验表明,该菌株发酵液能降低花生收获前黄曲霉毒素污染,降低率达97％,同时能较大程度地抑制土壤中黄曲霉菌的生长。　　 2.从培养特征、形态特征和18S rDNA序列分析等方面对该真菌进行系统鉴定,结果表明:该拮抗菌形态特征与绿色木霉相似,其18S rDNA序列与绿色木霉菌相似性达99％,确定其为绿色木霉菌一个变种,命名为T-vGZ101,并于2010年11月4日提交到中国典型培养物保藏中心保藏,保藏号为CCTCC M010291。　　 3.采用硫酸铵分级沉淀的方法证明该菌抑菌成份为蛋白质。采用阴离子交换柱层析和双向电泳方法,鉴定出3个与抗黄曲霉相关的蛋白质,经质谱检测和NCBI数据库搜索,证实其中一个为碱性蛋白酶,与Trichoderma hamatum的alkaline protease、Hypocrea lixii的serin endopeptidase同源性达45％,故命名为TvALP1,另两个为未知蛋白。　　 4.基于碱性蛋白酶的氨基酸序列,通过RACE克隆技术得到抗黄曲霉蛋白-碱性蛋白酶基因(TvALP1)全长序列,该基因长为1233 bp,编码410个氨基酸,通过生物信息学分析,分子量为43.85 kDa,等电点为9.21。SignalP分析其含有一段长为20个氨基酸的信号肽序列。克隆得到的TvALP1基因组长为1362bp,通过软件分析表明,其含有两个长分别为51 bp、78 bp的内含子,外显子与内含子连接区符合经典剪拼序列的GT-AG法则。　　 5.利用毕赤酵母表达载体分别构建了碱性蛋白酶基因TvALP1的胞外和胞内表达载体(pPICZαA-TvALP1和pPICZA-TvALP1)。继而,以重组质粒转化表达宿主菌GS115,梯度浓度抗生素Zeocin筛选获得了多拷贝重组菌株,并进行了诱导培养,SDS-PAGE检测结果表明TvALP1蛋白已在宿主菌中实现诱导表达。胞内表达的蛋白浓度高于胞外表达,但与其他蛋白在毕赤酵母中的表达相比,浓度较低。　　 6.分离纯化了重组蛋白TvALP1并进行酶活性检测。体外抑菌结果表明该重组蛋白TvALP1对黄曲霉生长、毒素的产生有较强抑制作用,琼脂扩散法测定最小抑菌浓度为7.5μg/mL。