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研究背景:手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种病毒性疾病,具有传染性。以发热、厌食、口腔黏膜多发性溃疡,和主要分布于手足等部位的小疱疹、斑丘疹为特点。病人大多为5岁以下的婴幼儿。自1997年开始,手足口病在亚太区域的流行日趋严重,2008年在安徽阜阳、新加坡,2009年在广东,手足口病的暴发和流行造成了成千上万的患儿,甚至导致了数百儿童的死亡。但遗憾的是手足口病的致病机制现今仍不明确,也没有针对性的的疫苗和抗病毒药物。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为小 RNA 病毒科(Picornaradae)、肠道病毒属(Enterovirus)的成员之一,是已知的手足口病的主要病原体之一,对于中枢神经系统(Central nervous system,CNS)有极高的感染性。1969年,EV71第一次从粪便标本中分离出来,在之后的几十年里该病毒已经在全世界许多国家中导致了多场流行与暴发,而且其预后差,病死率高,被视为脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)被控制后的危害最大的嗜神经性肠道病毒。MicroRNA(miRNA)是一种内生的、高度保守的非编码的单链RNA,长约20～24个碱基。研究证明miRNA不仅在各类原核、真核细胞中起到重要的转录后基因表达调节作用,还参与了 EV71与宿主之间复杂的相互作用。一方面,宿主细胞利用miRNA影响EV71自我复制,另一方面,EV71也可以利用miRNA影响细胞基因表达进而干扰细胞的正常功能。本研究尝试以人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc-MSCs)作为 EV71 体外感染的细胞模型,通过基因芯片和生物信息学技术研究miRNA在EV71感染过程中的改变,并探讨其潜在的作用机制。目的:本课题的目的是探讨MSC细胞对EV71病毒的易感性及以其作为研究EV71致病机制的细胞模型的可行性;同时通过基因芯片和生物信息学技术研究EV71感染过程中相关的信号通路,及与此相关的miRNA。我们希望通过本研究,可以进一步阐明miRNA在EV71病毒诱导的手足口病的致病机制,并为EV71病毒的预防与治疗提供借鉴价值。方法:一、MSC细胞的培养与鉴定1.Huc-MSC细胞的体外培养。2.通过流式细胞仪检测MSC细胞的免疫表型。二、EV71病毒滴度测定与细胞毒性实验1.采用Reed-Muench两氏法计算EV71的TCID50和病毒滴度。2.采用CCK-8试剂盒检测以不同MOI的EV71进行感染的MSC的细胞存活率。三、基因芯片检测1.采用TRNzol法提取总RNA,mirVanaTM miRNA Isolation Kit纯化总RNA。2.采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。3.利用基因芯片技术检测EV71病毒感染后相关mRNA、miRNA的变化。四、生物信息学分析与qRT-PCR1.利用Agilent GeneSpring软件分析基因芯片的荧光杂交图。2.利用qRT-PCR技术验证miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p的表达变化3.利用TargetScan、miRanda、PicTar和miRWalk四个生物信息学软件对目的miRNA进行靶基因预测。4.利用DAVID基因注释工具对异常表达的mRNA和目的miRNA的靶基因进行GO和KEGG分析。结果:1.经流式细胞仪检测,发现MSC细胞表面抗原,CD34和CD45分别为0.42%和0.06%,呈阴性表达,而CD44和CD90分别为98.96%和100%,呈阳性表达。2.通过Reed-Muench两氏法计算EV71毒株的半数组织培养感染剂量(Tissue culture infective dose,TCID50),经计算该毒株 TCID50=10-87/0.1ml,病毒滴度为 3.5×108PFU/ml。3.CCK-8法检测示:EV71对MSC有明显的细胞毒作用,其细胞存活率随着MOI的增高而降低。4.利用基因芯片技术共发现异常表达的miRNA共76条,mRNA共24条。5.qRT-PCR证实EV71感染后miR-6068和miR-575的表达量分别升高了 48倍和11倍,而miR-134-5p和miR-582-5p则分别降低了 16倍和15倍。6.通过GO分析,发现EV71病毒通过结合和催化的分子功能,干扰了代谢、信号转导、生物过程调控、免疫系统等生物过程,进而影响了细胞、细胞部件、细胞器、细胞膜的功能;在KEGG分析中其主要涉及整合素β1、细胞外基质(ECM)受体、粘着斑、PI3K-Akt等通路。7.EV71病毒与整合素β1的相互作用可以通过miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p进行调控。结论:MSC细胞对EV71病毒有易感性;EV71病毒通过调控整合素β1、细胞外基质(ECM)受体、粘着斑、PI3K-Akt等信号通路进而影响宿主细胞的正常功能;EV71病毒感染MSC后影响了其miRNA的正常表达,共发现76条异常表达的miRNA;EV71病毒与整合素β1的相互作用可以通过miR-6068、miR-575、miR-134-5p、miR-582-5p 进行调控。