论文部分内容阅读
目的筛选、鉴定调控食管鳞状细胞癌放射治疗敏感性的长链非编码RNAs,探讨其发挥调控功能的信号通路和分子机制。方法(1)根据“国家863肿瘤分子分型与个体化诊治”项目组、“肿瘤基因组”研究重大项目组、中国医药生物技术协会组织生物样本库分会制定的生物标本采集技术规范及数据库建立指南,在放射治疗前收集食管鳞癌患者的肿瘤组织。(2)所有入组病人均采取调强放射治疗,放疗结束后根据RECIST标准评估肿瘤放疗的近期疗效。根据近期疗效,分为肿瘤放射敏感组(CR+PR)和肿瘤放射抗拒组(SD+PD)。使用SPSS软件分析存活数据(总生存时间、无复发生存时间、无远处转移生存时间),Kaplan-Meier方法建立生存曲线,以对数秩检验进行差异比较,Cox比例风险模型进行按性别、年龄、ECOG评分、转移部位和治疗模型的多变量分析。P<0.05,为统计学差异有意义。(3)选取放射敏感和放射抗拒患者的肿瘤组织标本各3例,应用Agilent人类lncRNA芯片检测两组食管肿瘤组织标本中差异表达的lncRNAs,通过生物信息学分析、甄选与放射敏感性潜在相关的lncRNAs(候选lncRNA)。(4)应用PCR技术检测入组患者肿瘤组织标本候选lncRNAs的表达水平,结合患者的随访资料,分析候选lncRNAs与放疗近期疗效(short-term response)、总生存时间(overall survival,OS)、无局部复发生存时间(locoregional failure-free survival,LFFS)和无远处转移生存时间(distant failure-free survival,DFFS)的关系。根据候选lncRNAs表达量与近期疗效关系,构建ROC曲线,选择AUC最大的lncRNAs作为潜在的与ESCC放射敏感性相关的lncRNAs。结合患者的生存时间,最终确定放射敏感性潜在相关性最强的候选lncRNA。(5)根据上述确定的敏感性潜在相关的lncRNA基因序列,设计针对该候选lncRNA基因的siRNA和RNAmimic,构建mmic-/si-候选lncRNA质粒。选择食管鳞癌放疗敏感细胞系Eca109,X线辐射仪照射30Gy/3F,构建食管癌抗拒细胞系Eca109R。过表达/siRNA-候选lncRNA质粒瞬时转染Eca109/R细胞;PCR检测转染结果、MTT检测转染细胞增殖率,确定瞬时转染成功、细胞存活良好。(6)Mimic-/si-候选lncRNA转染Eca109和Eca109R细胞系,X线辐射仪照射0、2、4、6、8、1OGy,各剂量点PCR检测候选lncRNA的表达、MTT检测细胞存活率、Annexin-V流式细胞法检测细胞凋亡,评价mimic-/siRNA-候选lncRNA对Eca109/Eca109R细胞电离辐射敏感性的影响。(7)采用PiTAR、MIRDB和BLAST数据库共交集预测候选lncRNA的下游潜在靶基因,Luciferase reporter检测野生型和突变体候选lncRNA与下游潜在靶基因的关系,鉴定下游目标靶基因,并进行PCR验证。(8)结合文献预测候选lncRNA的下游潜在靶基因的潜在作用靶点,通过过表达/干扰候选lncRNA,PCR检测下游靶基因的变化,鉴定出下游靶基因的作用靶点,并通过蛋白免疫印迹(Western-blot)验证下游作用靶点基因蛋白表达变化。(9)构建过表达/siRNA-候选lncRNA慢病毒质粒,稳定转染Eca109/R细胞,PCR检测转染结果、MTT细胞存活检测,确定转染成功、细胞存活良好。建立移植裸鼠成瘤模型。测量肿瘤体积,记录成瘤曲线。成瘤后3天X射线10Gy/F肿瘤照射,记录肿瘤生长(体积、重量),制作肿瘤放射敏感性生长曲线,分析过表达/干扰候选lncRNA对裸鼠成瘤敏感性的影响。结果(1)2015年7月-2017年3月,就诊我院、接受根治性同步放化疗食管鳞患者共98例。符合入组标准的41例,放疗结束CR 4例(9.7%),PR 19例(46.3%),SD 9例(22%),PD 9例(22%)。放疗敏感和放射抗拒病人的临床特征包括性别、年龄、ECOG评分、肿瘤位置、临床分期等无明显得差别。末次随访日期2017年12月,存活26例,死亡15例,中位生存时间15个月。1y-OS、LFFS、DFFS分别为74.9%、84.8%和78.1%。放疗敏感与放射抗拒患者的1y-OS分别为 68.4%vs.49.3%(p=0.021);1y-LFFS 分别为 75.4%vs.75.4%(p=0.181);1y-DFFS 分别为 80.5,%vs.67.1%(p=0.919)。(2)Agilent人类lncRNA表达微阵列芯片检测6例(放射敏感、抗拒各3例)肿瘤新鲜肿瘤组织标本差异表达lncRNAs共113条,上调(fold change>2,p<0.05)和下调(fold change<0.5,p<0.05)的 lncRNAs 分别有 71、42 条。应用 Starbase 在线预测软件,选取其中差异前五位的、与放射敏感性潜在相关的lncRNAs-CASC2、FAM201A、DLEU2、DLX6-AS1、MCF2L-AS1 作为下一步研究对象。(3)收集另外35例患者食管肿瘤组织标本(20例敏感,15例抗拒),qRT-PCR检测两组肿瘤组织标本中 lncRNAs-CASC2、FAM201A、DLEU2、DLX6-AS1、MCF2L-AS1的表达量,发现CASC2、FAM201A、DLX6-AS1表达的差异有统计学意义,DLEU2、MCF2L-AS1表达差异不明显。结合ROC曲线,CASC2、FAM201A预测放射敏感性的特异性和敏感性明显优于DLX6-AS1。结合患者的随访资料,发现CASC2与放射敏感性成负相关,但与患者的生存没有相关性;FAM201A与放射敏感性成负相关,还与患者生存成负相关,从而认为FAM201A(family with sequence similarity 201 member A)与放射敏感性潜在相关性最强的lncRNA。FAM201A过表达放疗敏感性差,患者生存时间短(1y-OS为9.7%,p=0.002)。(4)过表达/siRNA-FAM201A转染Eca109细胞,PCR检测两组细胞FAM201A表达,与Ctrl细胞比较,过表达-RNAFAM201A明显高表达(1:3.291,p<0.001);si-RNAFAM201A 明显低表达(1:0.312,p<0.001),说明过表达/si-RNAFAM201A转染Eca109细胞成功。(5)相对于对照细胞,随着X射线剂量增加,过表达/si-RNAFAM201AEca109/R细胞存活率均下降。但在Eca109细胞中,当细胞DT 6Gy时,过表达FAM201A促进Eca109细胞存活的功能就表现出明显的差异(0.834 vs.0.913,p=0.024);而siRNA-FAM201A促进Eca109细胞死亡功能,在DT1OGy时才表现出差异(0.603 vs.0.364,p=0.001),说明对Eca109细胞,FAM201A更易于促进细胞对射线耐受。而在Eca109R细胞中,相对于对照细胞,DT 8Gy时,siRNA-FAM201A就可以明显促进Eca109R细胞死亡(0.913 vs.0.641,p=0.02),但过表达FAM201A并不能明显促进细胞存活,说明放疗抗拒细胞中FAM201A表达量已经很高,转染过表达FAM201A并不会继续增加Eca109R细胞对射线的耐受,但干扰FAM201A的表达可以显著的提高Eca109和Eca109R细胞电离辐射敏感性。Annexin-V流式细胞法细胞凋亡检测,支持上述结论。(6)采用PiTAR、MIRDB和BLAST数据库共交集预测miR1O1、miR590是FAM201A的下游潜在靶基因。相对于Eca109细胞,Luciferase reporter检测miR1O1与野生型和突变体FAM201A的荧光值分别为1:0.59(p<0.01),0.98:0.9(p=0.167);miR590野生型和突变体FAM201A的荧光值分别为1、0.91(p=0.30),1.02:1.0(p=0.950);说明FAM201A与miR1O1存在关系,但与miR590没有相关性。(7)结合文献认为ATM和mTOR蛋白是miR1O1的下游作用靶点,在Eca109/R细胞中,相对于对照细胞,FAM201A过表达的细胞中ATM和mTOR表达增高,miRNA101表达降低;而siRNA-FAM201 A细胞中ATM和mTOR表达下调,miRNA101表达增加。相对于未照射的细胞,X射线照射后,照射后细胞ATM和mTOR表达均增高。WB实验结果证实了 PCR的结果。说明FAM201A与miR101、ATM、mTOR表达密切相关。(8)确定过表达/siRNA-FAM201A慢病毒质粒转染Eca109细胞成功(PCR检测值 Ctr1,sh-NC,sh-FAM201A 分为 1、1.01、0.33,p<0.001),移植裸鼠成瘤。X线照射后,与NC、Ctrl相比,转染sh-FAM201A的Eca109细胞肿瘤体积、肿瘤增殖明显变慢,说明干扰FAM201A可以提高放疗敏感性,从而在动物水平证实FAM201A调控放射敏感性功能。结论FAM201A是一新的与食管鳞癌放射敏感密切相关的lncRNA。过表达FAM201A导致放射抵抗,患者生存时间短、预后差。干扰FAM201A表达可以提高食管癌细胞的电离辐射敏感性。FAM201A可能是通过下游靶点miRNA101介导的靶蛋白ATM、mTOR发挥放射敏感性调控功能。但FAM201A过表达的上游机制及调控食管癌敏感性的确切下游机制有待于进一步研究。