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研究目的在过去的几十年中,我国居民超重和肥胖发生率持续上升,目前已成为严重的公共卫生问题。近年来的一系列证据表明肥胖与阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)等神经退行性疾病发生发展相关。AD的典型的病理特征是大脑内β淀粉蛋白聚集形成老年斑(amyloid β-peptide,Aβ)和神经元内神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)以及胆碱能神经元大量丢失,主要表现为学习能力减退和记忆缺失。随着对AD和肥胖关系研究的不断深入,越来越多的研究表明早期AD患者脑内便出现大脑胰岛素抵抗和葡萄糖代谢障碍。肥胖引起的持续性高胰岛素血症会损伤血脑屏障(blood brain barrier,BBB),导致胰岛素转运异常。研究发现,连续8周的高脂饮食饲喂可导致大鼠外周胰岛素抵抗,饲喂12周大鼠可表现出大脑胰岛素抵抗。胰岛素降解酶(insulin-degradingenzyme,IDE)在机体内不仅可以降解胰岛素,也是机体唯一可以降解Aβ的蛋白酶。Aβ与IDE的亲和力比胰岛素低,在高胰岛素血症的状态下,过量的胰岛素无法完全被降解,并与Aβ相互竞争IDE,造成Aβ、胰岛素在脑内蓄积引发脑功能异常。环境中的许多化学物具有神经毒性。1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP)是一种有机溶剂,近年来作为一种臭氧层消耗物(ozonedepletingsubstance,ODS)替代品被大量生产。随着1-BP生产总量的提高和广泛应用,接触人群数量逐年增多。现研究显示1-BP具有不可忽视神经毒性,自应用以来,1-BP神经中毒病例不断被报道。1-BP可激活脑内胶质细胞,触发炎症反应。小胶质细胞受到刺激迅速发生“阿米巴样”改变并分泌白介素(interleukin)-1β、IL-10、转化生长因子(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)等促炎症因子后,然后以“分子对话(crosstalk)”的形式募集星形胶质细胞。星形胶质细胞和小胶质细胞相互作用加重,最终导致神经元损伤,诱发神经退行性疾病。随着经济快速发展和生活水平提高,高脂饮食在我国居民肥胖发生中的作用日趋明显。实际生活环境中,人体同时面临肥胖/高脂饮食与神经毒物共存的情况并不鲜见。两者对神经系统的损伤是否存在协同效应?是否与AD的发生相关?目前未见报道。基于课题组先前观察到的1-BP低剂量(100 mg/kg.bw)暴露2周,未观察到动物行为学改变及大脑损伤。本实验首先采用高脂饲料(high fat diet,HFD)诱导动物肥胖,观察肥胖与低剂量1-BP(100 mg/kg.bw)联合作用下,实验动物认知功能的损伤情况,以及脑内神经炎症变化、神经元损伤、脑胰岛素抵抗及Aβ含量的变化,探索肥胖和环境神经毒物对神经退行性病变的影响和机制,以期发现干预和治疗神经退行性病变的有效策略。研究方法1.实验动物分组和处理:48只SPF级Wistar雄性大鼠,体重70～90g,大鼠适应性喂养1周后,随机分为空白对照组(Con)、1-溴丙烷染毒组(1-BP)、高脂饮食组(HFD)、高脂饮食+1-溴丙烷染毒组(HFD+1-BP),每组12只。实验期间,Con组和1-BP染毒组喂饲普通维持饲料,HFD组和HFD+1-BP组给予高脂饲料(D12451,脂肪供能比为45%)。每周记录大鼠体重和食物消耗量。于实验第7周开始,给予大鼠1-BP染毒,1-BP经玉米油溶解稀释后,采用灌胃方式给1-BP组和HFD+1-BP组大鼠染毒,剂量为100 mg/kg.bw,玉米油灌胃体积为2ml/kg.bw;Con组和HFD组大鼠给予等体积玉米油灌胃,每周称量、记录大鼠体重和饲料消耗量,并按大鼠体重变化调整灌胃体积。2.糖水偏好实验:正式实验第1周进行糖水偏好实验(sucrose prefer test,SPT)检测大鼠行为、偏好。实验第16周时再次进行SPT实验,对比两次SPT实验结果是否有所改变。3.葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验:于实验第6周,尾静脉取血进行葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test,ITT),两次实验间隔5天。于实验第15周,尾静脉取血再次进行GTT实验和ITT实验,两次实验间隔5天。4.水迷宫实验:实验第16周进行Morris水迷宫实验记录逃避潜伏期、游泳总路程、游泳速度及穿越平台次数。5.组织病理:制备10 μm厚度的肝脏冰冻切片,采用油红O染色观察肝脏脂肪蓄积;制备40μm厚度的大脑切片,采用免疫组化法观察大脑中神经元的形态和小胶质细胞形态;利用FD Rapid GolgiStain Kit进行大脑高尔基染色,观察神经元树突形态。6.Western blot检测:检测大鼠大脑皮层和海马中IRS1、PI3K、AKT、p-AKT、GLUT1、GLUT3、GLUT4、Iba-1、GFAP、Aβ、BACE、PS1、IDE 的相对蛋白表达量。7.分离、鉴定外泌体:使用木瓜蛋白酶消化大脑组织后,采用超速离心法分离获得外泌体,利用透射电镜采集外泌体图像,并进行粒径测量。检测外泌体标志蛋白 Flotillin-1、Flotillin-2、Alix 及 IL-1β 的相对表达量。研究结果1.HFD和1-BP对大鼠体重影响:分别与Con组和1-BP染毒组相比,HFD组与HFD+1-BP组体重显著增加(P<0.05)。2.HFD和1-BP对大鼠葡萄糖代谢的影响:2.1第6周GTT和ITT:分别与两个普通饮食组(Con组和1-BP组)相比,两个高脂饮食组(HFD组和HFD+1-BP组)的葡萄糖耐量曲线下面积和胰岛素耐量曲线下面积均明显升高(P<0.01),提示高脂饮食导致大鼠血糖代谢紊乱、胰岛素抵抗。2.2第15周GTT和ITT:在GTT实验中,与Con组相比,1-BP组、HFD组和HFD+1-BP组的曲线下面积均有升高趋势,其中HFD组和HFD+1-BP组曲线下面积显著高于Con组(P<0.01,P<0.05);在ITT实验中,HFD组和HFD+1-BP组的曲线下面积显著高于Con组和1-BP组(P<0.01)。将此次结果与第6周实验结果对比发现,HFD+1-BP组葡萄糖耐量曲线和胰岛素耐量曲线发生了明显变化,HFD+1-BP的两条曲线相比于HFD组有升高趋势,1-BP组的两条曲线与Con组相比也有相同趋势。以上结果提示,1-BP染毒能够加重HFD引起的葡萄糖代谢紊乱和胰岛素抵抗。3.HFD和1-BP对大鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平的影响:分别与Con组和1-BP组相比,HFD组和HFD+1-BP组的空腹血糖水平显著升高(P<0.01);与Con组相比,1-BP组、HFD组和HFD+1-BP组空腹胰岛素水平呈上升趋势,HFD+1-BP组空腹胰岛素水平显著升高(P<0.05)。提示HFD+1-BP组大鼠出现胰岛素抵抗。4.HFD和1-BP对大鼠胰腺组织的影响:各组动物胰腺组织HE染色未观察到明显病理改变。5.HFD和1-BP对大鼠脑内经典胰岛素信号通路-胰岛素/IRS/PI3K/AKT的影响:与Con组相比,HFD+1-BP组脑内IRS1、PI3K和p-AKT表达量有降低趋势且差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05),提示脑内出现胰岛素信号通路受损。6.HFD和1-BP对大鼠脑内葡萄糖转运蛋白的影响:与Con组相比,HFD+1-BP组大鼠皮层和海马中GLUT1和GLUT3表达水平显著降低(P<0.01,P<0.05);与Con组相比,HFD+1-BP组大鼠海马中GLUT4表达水平显著降低(P<0.05),而皮层中GLUT4表达水平无显著差异(P>0.05)。提示大鼠脑内存在葡萄糖转运障碍。7.HFD和1-BP对大鼠神经行为学影响:7.1糖水偏好实验:第1周糖水偏好实验,与Con组相比,1-BP染毒组、HFD组、HFD+1-BP组大鼠行为无明显改变(P>0.05);第16周糖水偏好实验,与Con组相比,1-BP组和HFD组大鼠行为出现异常但差异无统计学意义,而HFD+1-BP组大鼠行为明显异常(P<0.05)。提示HFD和1-BP共同作用可以导致大鼠行为改变、偏好的改变。7.2水迷宫实验:在定位航行实验中,与Con组相比,1-BP组、HFD组、HFD+1-BP组大鼠的逃避潜伏期和游泳总路程均有延长,其中HFD+1-BP组与Con组的差异有统计学意义(P<0.05);在空间探索实验中,与Con组相比,1-BP组、HFD组、HFD+1-BP组大鼠的穿越平台次数均有所减少,其中HFD+1-BP组与Con组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。提示HFD和1-BP共同作用可以导致大鼠学习和记忆能力受损。8.HFD和1-BP对大鼠大脑神经元和树突棘的影响:与Con组相比,HFD+1-BP组大鼠大脑皮层、海马CA1、CA3区的神经元数目明显减少(P<0.05),NeuN蛋白表达量显著减少(P<0.01,P<0.05),单个神经元上树突棘减少,提示HFD和1-BP共同作用导致神经元损伤。9.HFD和1-BP对大鼠脑内Aβ蛋白水平影响:与Con组相比,HFD+1-BP组大脑皮层和海马中Aβ、APP、BACE和PS1蛋白表达水平显著增多(P<0.05);而IDE表达减少(P<0.05)。提示HFD和1-BP共同作用可使大鼠脑内出现Aβ蛋白沉积。10.HFD和1-BP对大鼠脑内胶质细胞的影响:与Con组相比,HFD+1-BP组大鼠小胶质细胞胞体明显增大,呈圆形,伪足明显,呈现“阿米巴样”变化,HFD+1-BP组大鼠皮层和海马中Iba-1表达量显著增多(P<0.01);与Con组相比,HFD+1-BP组大鼠皮层和海马中GFAP表达量显著增多(P<0.01,P<0.05)。以上结果提示,大鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞均被激活。11.HFD和1-BP共同作用导致大鼠脑内分泌大量含有炎性因子的外泌体:与Con组相比,HFD+1-BP组大脑组织提取到的外泌体中的IL-1β明显增多(P<0.05),提示HFD+1-BP共同作用可以加重脑内神经炎症反应。结论1.肥胖联合1-BP暴露可加重实验动物糖脂代谢紊乱,改变脑内胰岛素/IRS/PI3K/AKT信号通路,导致大鼠大脑胰岛素抵抗。2.肥胖联合1-BP暴露导致实验大鼠脑内出现Aβ产生增多、降解障碍,脑中蓄积;增强脑内炎症反应及神经元丢失。3.肥胖可增强低剂量1-BP的神经毒性,导致神经行为学改变。