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目的分别构建含乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV) prME蛋白与BALB/c鼠细胞间粘附分子(Intracellular adhesion molecule-1, ICAM-1)编码基因以及单纯ICAM-1编码基因重组质粒,比较ICAM-1编码基因不同构建方式对乙脑DNA疫苗诱导细胞免疫的免疫佐剂效应并探究ICAM-1编码基因免疫增强效应机制。材料和方法一、实验材料1、细胞与动物中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞与鼠肥大细胞瘤(P815)细胞分别购自中国科学院上海生命科学研究院上海细胞库,雌性、4周龄BALB/c鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。2、质粒与菌株含JEV prME蛋白基因的重组质粒被命名为pJME,由本实验室构建；原核表达载体pMD19-T simple和真核表达载体pcDNA3.1(+)分别购自Takara宝生物工程(大连)公司和美国Invitrogen公司。大肠杆菌JM109与DH5α购自Takara公司。3、其他试剂质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司,Lipofectamine2000购自Invitrogen公司,山羊抗鼠ICAM-1购自Santa公司,异硫氰酸荧光素(FITC)以及辣根酶标记的兔抗山羊IgG均购自北京中杉公司,乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒购自美国Promega公司。荧光标记的抗体(CD3-PerCP, CD4-APC, CD8-PE, CD54-PE, CD11c-APC, MHCⅡ-FITC, CD80-PE, CD86-FITC)均购自美国BD PharMingen公司。荧光染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)、异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(FITC-Dextran)均购自美国Molecular Probes公司。Mouse T Cell Lympholyte-Pure购自加拿大Cedarlane公司。丝裂霉素C购自美国Sigma公司。rmIL-2购自美国Peprotech公司。新霉素类似物(G418)购自GiBCO公司,限制性内切酶EcoRI、BamHI以及NotI等均购自Takara公司。IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γELISA试剂盒均购自上海森雄科技实业有限公司。ECL发光试剂盒购自美国Pierce公司。二、实验方法1、pICAM-1、pJME/ICAM-1的构建和鉴定从BALB/c鼠脾脏细胞中提取总RNA,参照(Genbank X52264.1),以总RNA为模板,采用套式-RT-PCR法扩增ICAM-1CDS区域序列(1614bp),将后者克隆到pcDNA3.1(+) (EcoRI/NotI),构建重组质粒pICAM-1。限制性内切酶BamHI/EcoRI酶切pJME,获取JEV prME基因(2001bps)并克隆到pICAM-1 BamHI/EcoRI之间,构建融合pJME/ICAM-1.后者通过转化大肠杆菌DH5a、提取、电泳、测序以及酶切等方法进行鉴定。脂质体法将pJME/ICAM-1转染至CHO细胞,于转染后72h,经G418(800μg/mL)进行细胞筛选7d,再经G418(400μg／mL)持续筛选4周并获得CHO细胞阳性克隆,采用免疫荧光和免疫印迹法检测ICAM-1以及融合蛋白prME/ICAM-1的表达。2、动物和免疫程序每组8只BALB/c鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)共5组。分别将溶于100μL灭菌PBS的不同免疫原鼠后肢肌内注射,包括：pJME、pJME/ICAM-1、pJME+pICAM-1、pcDNA3.1(+)(阴性对照)各100μg以及腹腔注射JE灭活疫苗组(阳性对照)。JE灭活疫苗(JEV北京株,辽宁省疾病控制中心惠赠)100μL／次(相当于1／5成人剂量),共免疫3次,间隔2周。3、小鼠脾脏T淋巴细胞和树突状细胞的分离脱颈法处死小鼠,无菌打开腹腔,取出脾脏放入冷PBS中,将其捻碎并滤过100目无菌钢网,收集脾细胞悬液,按照产品说明书操作制备脾脏T淋巴细胞；另取部分上述脾细胞悬液,1300 r/min洗涤5 min×3次；用完全培养基20 mL重悬细胞于250 mL培养瓶(Falcon公司)中,37℃,5%CO2培养箱内孵育2 h；用完全培养基20 mL剧烈洗摇培养瓶,并吸弃悬液,共4次；加入完全培养基20 mL,37℃,5%C02培养箱内孵育过夜；收集悬浮细胞。4、脾脏树突状细胞表型和功能取制备脾脏DC细胞悬液,流式细胞仪检测DC表面分子CD54、CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86、DC摄取FITC-Dextran能力以及DC刺激T淋巴细胞增殖能力。5、T淋巴细胞亚群与CTL功能检测取制备脾脏T淋巴细胞悬液,流式细胞仪分析鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群特点,乳酸脱氢酶释放法检测CTL活性。6、ELISA法检测T细胞、DC分泌细胞因子水平操作步骤按产品说明书进行,显色后即刻用WellscanMK3酶标仪(Lab-systems公司)检测492nm波长的吸光度A值,根据标准曲线计算IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10的含量。结果1、pICAM-1、pJME/ICAM-1的构建和鉴定测序分析显示：JEV prM、E蛋白和ICAM-1编码基因与发表的序列相符。pICAM-1经EcoR I/Not I酶切释出插入子,与ICAM-1基因(1614bp)大小相一致,pJME/ICAM-1经BamHI/EcoRI酶切释出插入子与pJME经相同酶切释出插入子(2001bps)的基因片段大小相一致,pJME/ICAM-1经BamHI/NotI酶切释出的插入子约为3660bp,为鼠ICAM-1编码基因与JEV prME蛋白编码基因之和。免疫荧光结果显示：pICAM-1、pJME/ICAM-1转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布在胞质,也可见于胞膜。单纯载体转染的CHO细胞及未经质粒转染的正常CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记。转染pJME/ICAM-1的CHO细胞的Western blot分析显示,在分子量约为130×103区域处可检测到一蛋白条带,与prME和ICAM-1的分子量之和相一致,转染pICAM-1的CHO细胞的Western blot分析显示,在分子量约为60×103区域处可检测到一蛋白条带,而转染pcDNA3.1(+)的CHO细胞未见相应的条带。2、pICAM-1、pJME/ICAM-1对小鼠脾脏DC表型和功能的影响各组DC表面表达高水平MHCⅡ, pJME/ICAM-1组、pJME+pICAM-1组、pJME组高于JE灭活疫苗组及空载体免疫组(P<0.05),三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；pJME/ICAM-1组DC表面CD80表达水平最高,高于pJME组、JE灭活疫苗组及空载体免疫组(均P<0.05), pJME/ICAM-1组与pJME+pICAM-1组比较,差异无统计学意义(P>0.05); pJME组与JE灭活疫苗组DC表面CD86比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05); pJME/ICAM-1组、pJME+pICAM-1组DC表面表达高水平ICAM-1,高于pJME组,JE灭活疫苗组及空载体免疫组(均P<0.05),两组间比较差异有统计学意义(P<0.05), pJME组,JE灭活疫苗组DC表面ICAM-1表达水平高于空载体免疫组(P<0.05),两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。pJME/ICAM-1组与pJME+pICAM-1组内吞能力较强,显著高于其它各组(P<0.05)。pJME/ICAM-1组与pJME+pICAM-1组比较差异无统计学意义(P>0.05)。比较不同免疫原对细胞分裂的作用,以pJME/ICAM-1组最强,(73.69±7.32)%CD4+T细胞发生分裂,(45.40±2.57)%CD8+T细胞发生分裂,显著高于对照组(P<0.05); pJME+pICAM-1组次之,(53.48±5.23)%CD4+T细胞发生分裂,(35.85±4.46)%CD8+T细胞发生分裂,显著高于pJME组、JE灭活疫苗组及空载体免疫组(均P<0.05)。3、细胞免疫反应的检测pJME/ICAM-1组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为(36.1±6.45)%,明显高于其它组(P<0.05); pcDNA3.1(+)组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为(20.87±4.45)%,低于其它组(P<0.05); pJME+pICAM-1组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为(31.23±6.55)%,高于pJME组(25.26±9.72)%及JE灭活疫苗组(25.35±3.82)%(P<0.05)。各免疫组间CD3+CD8+T淋巴细胞比例无显著性差异(P>0.05)。各组免疫鼠CTL活性由高至低依次为：pJME/ICAM-1组(56.38±5.69)%、pJME+pICAM-1组(50.37±6.33)%、pJME组(35.25±4.78)%、JE灭活疫苗组(26.72±3.78)%、pcDNA3.1(+)组(12.34±7.73)%,各组间比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。4、小鼠脾T淋巴细胞和DC分泌细胞因子水平的测定pJME/ICAM-1组与pJME+pICAM-1组T淋巴细胞和DC分泌IL-12、IFN-γ水平较pJME组、JE灭活疫苗组及空载体免疫组明显升高(均P<0.05),两组间比较,前者T淋巴细胞和DC分泌IL-12、IFN-γ水平显著升高(P<0.05)。各组间T淋巴细胞IL-4分泌水平比较差异无统计学意义(均P>0.05),JE灭活疫苗组T淋巴细胞分泌IL-10的水平高于其它实验组(均P<0.05)；JE灭活疫苗组DC分泌IL-10、IL-4的水平高于其它实验组(均P<0.05),其余各组间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论1、成功构建了融合表达重组质粒pJME/ICAM-1以及单质粒pICAM-1,并能在真核细胞内有效表达目的蛋白；2、ICAM-1编码基因能够促进T细胞分泌细胞因子,促使CD4+T细胞向Thl细胞分化；3、ICAM-1编码基因能够增强T细胞对靶细胞的细胞毒效应；4、树突状细胞能够通过ICAM-1编码基因调节Th1/Th2免疫平衡；5、ICAM-1编码基因能够促进JE DNA疫苗脾脏DC的成熟；6、ICAM-1编码基因能够提供独立或放大B7分子的协同刺激信号；7、相对于联合免疫组,融合质粒免疫组诱导更强的细胞免疫反应。