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黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是一种由产毒黄曲霉（Aspergillus flavus）,寄生曲霉（A.parasiticus）产生的次级代谢产物。AFB1的结构在中性条件下稳定,碱性条件下易分解,酸性条件下会重新合成,在高温烹饪及冷冻条件下,均无法被破坏。AFB1经常污染农产品及酿造食品,对国内外贸易及人体健康产生不可估量的影响。因此许多国家已经颁布了AFB1在食品药品中的限量标准。据此,开发快速、灵敏、便捷、准确的检测AFB1的方法尤为重要。基于抗原抗体反应的AFB1免疫分析方法,具有快速,简单,操作简便的优点,但是高灵敏度高特异性抗体是该方法的核心技术之一。传统抗体虽然技术成熟、制备过程简单,但是抗体的特异性与免疫原的结构、免疫动物的个体、批次等都密切相关,而且实验人员和免疫动物都暴露在AFB1下,具有潜在的健康危害。而基于噬菌体展示技术淘选待测物的靶标物质是一种安全、有效的筛选方法,具有成本低廉、操作便利、稳定可靠等优点。噬菌体展示技术是指将多肽展示在噬箘体表面上,该方法已成功应用于抗原表位的模拟、重组抗体的构建等方面。然而该技术也有其局限性,如:展示在噬菌体上的多肽的结构和结合位点受到一定的限制;背景吸光值高,影响检测结果;抗M13二抗高昂的价格,不利于大规模检测等,若能够化学合成噬菌体展示的多肽,则可减少使用大肠杆菌的环节,有效避免生物危害。因此本文利用噬菌体展示技术淘选出与AFB1竞争性结合抗体的多肽以及与“AFB1-抗体”复合物结合的非竞争性多肽,而后利用淘选到的最优多肽,根据DNA测序结果进行化学合成多肽,初步分析多肽的理化性质、二级结构,旨在建立基于噬菌体来源多肽检测AFB1的免疫分析方法。与传统的噬菌体多肽相比,合成的多肽,减少了噬菌体在大肠杆菌中繁殖的过程,因此安全性更高;且暴露了更多的结合位点,便于功能性质的发挥。除此之外,本方法使用环状肽库淘选多肽。与线性肽库中淘选到的多肽相比,环状肽库由于具有两个半胱氨酸氧化形成二硫键,增加筛到目标多肽的可能性。研究结果如下:1.通过AFB1抗体从噬菌体展示环七肽库（Ph.D.-C7C）中淘选多肽基于实验室制备的抗体AFB1-Mab（2F5）,Pab,AFB1-Mab（4E9）从Ph.D.-C7C中通过竞争性方法与非竞争性方法淘选到与AFB1竞争性结合抗体的多肽以及与“AFB1-抗体”结合的非竞争性多肽。共进行三轮淘选,每轮淘选中包被抗体的浓度是100μg/m L,50μg/m L,25μg/m L,PBST中吐温-20的浓度为0.05%,0.1%,0.15%。利用竞争性淘选方法共筛到19个阳性克隆,非竞争性淘选方法共筛到12个阳性克隆。利用噬菌斑培养后的上清液进行测定,3-C-43阳性克隆与AFB1竞争性结合AFB1-Mab（2F5）的能力最强,建立了phage ELISA分析方法,其灵敏度IC50为60ng/mL。提取该阳性克隆的DNA进行测序,并翻译为氨基酸,其外源展示多肽序列为CVPSKPGLC。使用Rotparam程序在线分析理化性质,显示该多肽的分子量为903.12Da,等电点为8.06,不稳定系数为34.93（＜40）,稳定性较好,平均亲水系数是0.522,亲水性较低,使用有机溶剂DMF将其溶解。2.生物素化多肽的合成与性质表征将生物素EZ-Link NHS-LC-Biotin与化学合成后的多肽以2:1、1:1两种比例连接,竞争性pELISA（Biotinylated-peptide ELISA）的结果显示2:1连接后与抗体的结合能力更强。透析后,通过CD测定VPSKPGL与CVPSKPGLC结构差异,结果显示当多肽两端连有半胱氨酸后,α-螺旋降低,β-转角降低至29.5%,无规卷曲从37.7%降低至34.9%,稳定性增强,这与环状多肽稳定性优于线性多肽相一致。探究不同保存温度与时间下,生物素化多肽与抗体结合能力同噬菌体展示多肽与抗体结合能力的差异,分别将二者于4℃（常用快速贮藏温度）与25℃（实验反应温度）贮藏0h、8h、22h、30h、44h、52h,结果显示,前44h时,随着贮藏时间增加,生物素化多肽与抗体结合能力逐渐降低,在52h时,4℃保存条件下,生物素化多肽与抗体结合的能力依然保留约40%,而噬菌体展示多肽与抗体结合能力仅保留约20%。25℃时结果相同。因此,生物素化多肽稳定性在4℃和25℃时比噬菌体展示多肽强。3.基于噬菌体来源多肽测定AFB1免疫分析方法的建立基于生物素化多肽建立检测AFB1的竞争性pELISA分析方法,通过优化封闭液、有机溶剂的种类和浓度以及不同p H的样品稀释液,确定最佳检测条件。实验结果确定3%脱脂牛奶作为封闭液,10%甲醇、p H 7.2的样品稀释液为最佳条件,在该条件下,pELISA的灵敏度高,IC50为0.92ng/m L,检测范围IC20-IC80为0.23ng/m L-3.36 ng/m L。随后,测定与AFB1结构类似物及常见的几种真菌毒素的交叉反应,结果显示交叉反应率均低于1%,说明该方法特异性较好。以大米作为实际样品,分别添加10ppb、20ppb和40ppb的AFB1,经过甲醇提取稀释后,测定添加回收率为84%-96.7%。