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D型流感病毒是近年来新发现的一种流感病毒,宿主范围、地域分布广泛,与其它呼吸道病毒共同引起严重的牛呼吸道疾病,给家畜养殖业造成威胁,并存在跨越种间屏障向人类传播的风险。国外已有关于灭活苗和DNA疫苗研究的报道,而国内对于D型流感疫苗的研究尚未有报道。D型流感病毒基因组由7个RNA片段组成,共编码9种蛋白。血凝素酯酶融合蛋白（Hemagglutinin-esterase-fusion,HEF）是D型流感病毒唯一的糖蛋白,具有A型流感病毒血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）蛋白的功能,且有较强的免疫原性,是开发预防性疫苗的关键免疫原。本研究采用反向遗传学技术拯救了2株表达HEF蛋白的重组新城疫病毒,分别命名为NDV-F-HEF（NDV97 F裂解位点替换为Lasota裂解位点的突变病毒）、MG7-HEF（NDV97 F裂解位点替换为Lasota裂解位点、NP蛋白缺失18个氨基酸的突变病毒）,并对获救的两株病毒部分生物学特性及免疫效果进行评价。重组新城疫病毒的拯救及其部分生物学特性鉴定:通过激光共聚焦和免疫印迹实验验证重组新城疫病毒能够表达D型流感病毒的HEF蛋白;将重组病毒传代至15代,测序验证重组病毒的遗传稳定性,结果显示HEF基因在重组新城病毒MG7-HEF、NDV-F-HEF中可以稳定遗传;对两株重组新城疫病毒及其亲本毒株的最小致死量鸡胚平均致死时间（Mean Death Time,MDT）、1日龄鸡脑内接种致病指数（Intracerebral Pathogenicity Index,ICPI）、静脉接种致病指数（Intravenous Pathogenicity Index,IVPI）及在鸡胚成纤维细胞上的生长能力等进行了测定和比较,结果显示外源基因HEF的插入使NDV-F-HEF重组毒的毒力较NDV-F株减弱,MG7-HEF的毒力与亲本毒MG7相当;两株重组病毒在细胞上的生长能力、生长趋势均与亲本病毒保持一致。两株重组病毒的免疫效果评价:将两株重组病毒MG7-HEF、NDV-F-HEF以肌肉注射的方式免疫BALB/c小鼠,采集小鼠血清。检测血清中HEF特异性IgG抗体及其亚型IgG1和IgG2a抗体含量,发现两株重组病毒（MG7-HEF、NDV-F-HEF）免疫的小鼠血清中HEF特异性抗体IgG及其亚型IgG1和IgG2a均可检测到。第四次免疫后HEF特异性IgG抗体在血清中的含量达均到了2800 ng/m L,其中重组病毒NDV-F-HEF抗体含量高于MG7-HEF,无统计学差异。通过计算分析发现,两株重组病毒的免疫反应中Th2/Th1比率约为2。通过酶联斑点免疫（Enzyme-linked immunospot assay,ELSPOT）试验检测重组病毒免疫组小鼠淋巴细胞中分泌IL-4和IFN-γ的细胞数量,与此同时利用细胞增殖实验对细胞免疫反应的效果进行评价。评价结果显示重组病毒MG7-HEF、NDV-F-HEF免疫组的细胞增殖能力和IL-4、IFN-γ分泌细胞数均高于亲本对照组和PBS对照组,两株重组病毒中NDV-F-HEF免疫组的各项检测结果均略高于MG7-HEF免疫组,但差异不显著,说明两株重组病毒均有作为候选疫苗株的潜力。综上所述,本研究拯救了表达D型流感病毒HEF蛋白的重组新城疫病毒MG7-HEF和NDV-F-HEF,并确定两株重组病毒均为弱毒株;经验证两株重组病毒符合用于疫苗株的安全性要求;动物试验评价其免疫原性,证明其可以刺激小鼠机体产生体液免疫和细胞免疫。本研究丰富了国内关于D型流感疫苗研发的相关内容,对D型流感载体疫苗研究进行了初步探索。