论文部分内容阅读
灰树花(Grifola frondosa)是一种生长在亚热带至温带的名贵珍稀药食两用真菌,又名贝叶多孔菌、云蕈、舞茸。在我国河北、浙江、四川、吉林、福建等省均有分布,并且在浙江、河北等省已实现规模化栽培,产量逐年增加。中医认为灰树花有“扶正固本”之效,东汉时期的《神农本草经》记载其“调和脾胃,安定神志”的功效。现代医学研究证明,灰树花多糖具有显著的抗癌、保肝、降血压、提高免疫力等诸多药理活性。灰树花的营养和药用价值,正引起愈来愈多学者的关注。本文对灰树花多糖进行了分离纯化和结构的初步分析,追踪检测了所得各个灰树花多糖的免疫活性,获得具有免疫活性的灰树花均一多糖,并深入探讨了灰树花均一多糖对巨噬细胞的活化作用,以期为灰树花中药资源和天然免疫药物的开发提供理论依据。第一部分,灰树花子实体多糖的提取和分离纯化。采用热水提取、乙醇分级沉淀法获得灰树花子实体粗多糖GFP75、GFP50和GFP30三个部分；利用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析对粗多糖GFP75进行纯化,利用梯度洗脱的方法,得到GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6等六个灰树花多糖组分；选取多糖GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4进行Sephacryl S系列凝胶柱层析(GFP75-3先经离子柱层析再进行凝胶柱层析),获得四个灰树花多糖,即GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B;利用HPLC法检测其纯度,结果显示,所得四个灰树花多糖为均一多糖。第二部分,灰树花均一多糖的结构初步解析。采用现代色谱和光谱技术对得到的均一多糖进行了初步结构分析。高效液相色谱(HPLC)检测结果显示四个均一多糖GFP75-2C、GFP75-2D、GFP75-3C1、GFP75-4B的分子量分别是1.6×104Da、3×103Da、7.1×104Da和4.2×105Da。紫外光谱(UV)表明四种均一多糖均不含蛋白质和核酸等成分。运用高效阴离子色谱(HPAEC)、红外光谱(IR)和核磁共振(NMR)技术分析了四个均一多糖的糖环构型和单糖组成,结果显示灰树花多糖GFP75-2C是含有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的a-吡喃型中性杂多糖,灰树花多糖GFP75-2D是含有岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖的呋喃型中性多糖,灰树花多糖GFP75-3C1是含有岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的酸性多糖,灰树花多糖GFP75-4B是含有岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖的中性多糖。第三部分,灰树花子实体多糖的免疫活性研究。运用活性追踪的方法,利用巨噬细胞分泌NO实验和小鼠淋巴细胞增殖实验追踪检测了分离纯化过程中得到的各个组分的免疫活性。粗多糖GFP75经体外刺激巨噬细胞分泌NO实验和刺激小鼠淋巴细胞增殖实验证明,其具有一定的体外免疫活性；通过体外细胞实验,发现粗多糖GFP75-1、GFP75-2、GFP75-3、GFP75-4、GFP75-5和GFP75-6均有免疫活性,其中,GFP75-2、GFP75-3和GFP75-4对巨噬细胞和淋巴细胞皆具有免疫活性,对这三个组分进一步纯化获得的四个均一多糖中,除灰树花多糖GFP75-2C外,均有免疫活性,与相应的DEAE离子柱组分相比,灰树花多糖GFP75-2D刺激巨噬细胞分泌NO活性显著提高,灰树花多糖GFP75-3C1刺激巨噬细胞分泌NO活性和刺激淋巴细胞增殖活性稍有提高,灰树花多糖GFP75-4B刺激巨噬细胞分泌NO活性有所降低。第四部分,灰树花均一多糖GFP75-2D对巨噬细胞的活化作用研究。选取体外免疫活性显著的灰树花均一多糖GFP75-2D,研究了其对巨噬细胞免疫的活性机制。采用Griess法测定了灰树花多糖对巨噬细胞NO释放量的影响,酶联免疫吸附法(ELISA法)检测了灰树花多糖对巨噬细胞分泌细胞因子的影响,RT-PCR法检测灰树花多糖对巨噬细胞表达相关细胞因子mRAN表达量的影响。研究发现,灰树花多糖GFP75-2D对巨噬细胞有活化作用,刺激细胞体积变大,形成伪足；与阴性对照相比,灰树花多糖GFP75-2D处理后的RAW264.7细胞NO释放量显著增加,并且NO的释放量与灰树花多糖存在剂量依赖性；与未经样品刺激组相比,灰树花多糖GFP75-2D处理后的RAW264.7细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子的量明显增多,同时TNF-α、IL-1p和IL-6等细胞因子mRNA的表达量也增多。表明灰树花多糖GFP75-2D能够多途径激活巨噬细胞,增强巨噬细胞的生物活性,具有良好的免疫增强作用。