目的:宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来,宫颈癌的发病率,尤其是年轻妇女的发病率明显增加。随着新辅助化疗的发展和医学模式的转变,化疗已成为宫颈癌治疗中不可或缺的治疗手段。在宫颈癌的化疗中,使用一些毒性小的天然抗肿瘤药物,充分发挥其治疗作用,减少对正常细胞的损伤,成为当前研究的一大热点。大蒜素(Allicin)是大蒜中主要生物活性成分的总称。近年来,体外实验证实大蒜素能够通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤的发生。本研究以人宫颈腺癌Hela、鳞癌Caski细胞株为对象,通过检测用药前后TRAIL蛋白的表达、caspase-8的表达和活性变化,探讨大蒜素对宫颈癌细胞生长的影响及其作用机理。从而为大蒜素应用于临床肿瘤的辅助治疗提供充分的实验室依据。方法:1细胞培育:常规复苏冻存的Hela、Caski细胞接种于100ml培养瓶中,加入青、链霉素,使青霉素浓度为100IU/ml,链霉素浓度为100ug/ml, 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内松盖培育。以0.25%胰蛋白酶消化传代。2细胞增殖实验:取对数生长的Hela、Caski细胞,制成浓度为6×104个/ml的细胞悬液,接种到96孔培养板中,每孔100ul,置于37℃CO2培养箱中培养,培养24h后,换培养液,加入含有不同浓度大蒜素(6.25, 12.5, 25, 50, 75, 100mg/L)的培养基。设空白对照孔(只加培养基)。每一浓度均设6个平行孔。继续培养24、48和72小时后,每孔加入10ul浓度为5mg/ml的MTT溶液,放回培养箱继续孵育4小时。吸净上清液,每孔加入二甲基亚砜100ul,振荡器上振荡8-10min,用酶标光度仪在波长为492nm时测定每孔的吸光度(OD)值。每个实验均重复3次。3流式细胞仪检测Hela、Caski细胞TRAIL及其受体DR4,DR5的表达:取对数生长期细胞以4.5×104 /ml的密度接种于培养瓶,置于孵箱中培养,待每瓶细胞生长至80-90%时,收集细胞,上样流式细胞仪检测TRAIL及其受体的表达。4流式细胞仪检测大蒜素对Hela、Caski细胞TRAIL配体表达的影响:将浓度为4.5×104个/ml细胞接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期,换培养液,分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(加入含不同浓度的大蒜素的培基),培养48h后,收集细胞,上样流式细胞仪进行TRAIL配体表达量分析,以检测样品荧光指数(FI)表示。实验重复三次取平均值计算大蒜素处理前后细胞TRAIL配体表达的FI值。5用Caspase-8活性检测试剂盒检测大蒜素对Hela、Caski细胞株Caspase-8活性的影响:将浓度为4.5×104个/ml细胞接种于接种于培养瓶。待细胞生长至对数生长期,换培养液,分为对照组(仅加培养基)、大蒜素组(加入含不同浓度的大蒜素的培基),培养48h后,收集细胞,按照说明书操作,用分光光度计测定OD405。通过OD实验组/OD对照组的比值检测大蒜素对两种细胞Caspase-8活化程度的影响。实验重复三次。6 RT-PCR方法检测大蒜素对Hela、Caski细胞株TRAIL配体及Caspase-8表达的影响: (1)细胞株RNA的提取:细胞经大蒜素处理12h后,取1×106个/ml细胞行裂解、按Trizol Reagnt试剂盒说明提取各组细胞的总RNA。(2) cDNA的合成(3)PCR的扩增(4)琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察TRAIL、Caspase-8与β-actin基因扩增产物电泳条带的吸光度比值,表示TRAIL、Caspase-8的相对表达水平。统计学方法:细胞吸光度值(OD)和TRAIL、Caspase-8表达用±s表达,多组间比较,采用方差分析。计数资料用χ2检验。所有数据均用SAS软件包进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1. Hela、Caski细胞的形态学观察:倒置显微镜观察:对照组细胞生长状态良好,细胞伸展,呈不规则多角形。加药培养48h后细胞数目减少,细胞明显皱缩,体积变小,细胞间隙增大,有凋亡小体形成,(Fig.1)。2.大蒜素对Hela、Caski肿瘤细胞生长影响:用6.25, 12.5, 25, 50, 75, 100mg/L的大蒜素处理人宫颈癌Hela、Caski细胞24、48、72h后,随着药物浓度和作用时间的增加,抑制率增高,表现为时间和剂量依赖关系,(Fig.2,3)。各组抑制率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.经流式细胞仪检测Hela和Caski细胞TRAIL配体及其受体DR4,DR5的表达阳性,(Fig.4)。4.流式细胞仪检测:大蒜素作用48小时后Hela细胞和Caski细胞TRAIL配体的表达明显上调,Hela细胞TRAIL配体的FI值由用药前的1.96升高到2.43;Caski细胞TRAIL配体的FI值由用药前的2.02升高到2.54,两种细胞用药前后TRAIL配体表达变化比较差异有统计学意义(P<0.05),(Tab 9),(Fig.5)。5.Caspase-8活性检测:经大蒜素作用48小时后,Hela细胞和Caski细胞Caspase-8活性明显增加,Hela细胞Caspase-8活性的OD实验组/OD对照组是对照组的2.26倍;Caski细胞Caspase-8活性的OD实验组/OD对照组是对照组的1.69倍,两种细胞用药前后Caspase-8活性变化比较差异有统计学意义(P<0.05),(Tab10)。6.RT-PCR检测:经大蒜素作用12小时后, TRAIL配体及Caspase-8mRNA基因扩增产物与β-actin基因扩增产物电泳带的吸光度比值明显升高,Hela细胞为对照组的1.43、1.47倍, Caski细胞分别为对照组的1.39、1.55倍(P<0.05 ),两种细胞用药前后TRAIL配体及Caspase-8mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.05) (Tab11)。结论:(1)大蒜素对宫颈癌Hela和Caski细胞的生长有明显的抑制作用,且随时间和剂量增加抑制率明显上升。(2)大蒜素对Caski细胞的促凋亡作用较Hela细胞敏感。(3)宫颈癌Hela和Caski细胞是TRAIL敏感细胞株。(4)大蒜素可在转录和蛋白水平上调宫颈癌Hela和Caski细胞株TRAIL配体的表达,提示通过TRAIL系统介导的死亡途径促进肿瘤细胞凋亡可能是大蒜素抑制肿瘤的机制之一。(5)大蒜素可在转录水平上调宫颈癌Hela和Caski细胞株Caspase-8mRNA的表达,亦可激活Caspase-8的活性,提示通过作用于启动型caspase Caspase-8的表达,循半胱氨酸蛋白酶(caspase)通路诱导细胞凋亡是大蒜素促调亡的另一机制。上述结论为大蒜素应用于宫颈癌的辅助治疗提供充分的实验室依据。