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糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是重要的糖尿病微血管并发症之一。在西方发达国家，DN已成为终末期肾病(end stage renal disease,ERSD)的主要原因，近年来我国的ERSD中由DN引起的比例也在逐渐增加。大量循证医学证据表明应用血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensin receptor blockaders，ARBs)抑制肾脏局部肾素．血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的过度兴奋，可减轻尿蛋白，减少系膜基质积聚，延缓DN的进展。但对于一个早期糖尿病的患者，在出现微量白蛋白尿之前，甚至在糖尿病出现时，早期应用ARBs能否预防或延缓DN的发生或进展?尚无明确定论，本实验以早期糖尿病的SD大鼠为研究对像，探讨缬沙坦对早期糖尿病大鼠肾脏改变的影响。
研究目的
1．早期糖尿病大鼠肾脏病变的观察。
2．缬沙坦对早期糖尿病大鼠肾脏病变的影响。
材料与方法
1．糖尿病模型的建立选用220克左右清洁级SD大鼠，适应性饲养1周，用5﹪水合氯醛300mg/kg腹腔内注射麻醉，手术切除右肾以加速DN的形成，2周后予35mg/kg/天STZ(以无菌0.01mol/L枸橼酸．枸橼酸钠液在冰浴中新鲜配制，pH4.5)连续3天腹腔内注射诱导糖尿病，非糖尿病组大鼠予腹腔内注射等量枸橼酸-枸橼酸钠液。缬沙坦治疗组在注射STZ当天开始予50mg/kg/天缬沙坦(北京诺华公司提供，160mg/粒，用蒸馏水配制混悬液)灌胃，注射STZ 3天后尾静脉采血(强生One-Touch血糖仪)检测随机血糖水平，若注射后随机血糖水平≥16.7mmol/L，即可视为糖尿病模型建立成功。所有大鼠实验期间自由进食、饮水，每周监测体重和血糖。糖尿病组大鼠根据血糖水平皮下注射鱼精蛋白锌胰岛素1.3U/d，以保证血糖维持16.7mmol/L以上，同时降低酮症的发生，减少模型大鼠的死亡。
2．实验分组
实验动物随机分为4组：糖尿病治疗组(DV组)，糖尿病对照组(DM组)，缬沙坦对照组(V组)，正常对照组(N组)。
3．标本留取
糖尿病成模后2周、4周、8周分别收获动物留取标本。糖尿病造模前及收获前1天置代谢笼收集24h尿，离心后留取上清液置于-20℃冰箱保存待检。收获时5﹪水合氯醛麻醉，抽取腹主动脉血，分离血清置于-20℃冰箱保存待检；同时快速切取肾脏，部分肾组织置10﹪中性缓冲福尔马林固定，部分置于电镜固定液中。
4．标本测定
4.1血尿生化检测血糖测定用强生公司One-Touch血糖仪及配套试纸。血脂、肝功能、肾功能用日立7210全自动生化分析仪检测，尿肌酐用苦味酸法，尿蛋白用双羧脲法。内生肌酐清除率(ml/min)=[尿肌酐(mg/dl)×24h尿量(ml)]/[血肌酐(mg/dl)×1440(min)]。
4.2 肾脏组织病理检查 (1)光镜：肾组织标本用10﹪中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4um，行HE和PAS染色，光镜下观察肾组织病理改变。取PAS染色切片，在400倍显微镜下，每张切片随机取20个完整的肾小球，用Image-pro-plus 5.0图像分析系统分析，盲法计算。肾小球截面积。(2)电镜：
每组随机选取1只大鼠肾皮质标本，于3﹪戊二醛中固定，常规制作电镜标本，观察肾小球基底膜变化，系膜细胞及细胞外基质情况等。 4.3免疫组织化学分析采用S-P法染色，切片常规脱蜡水化后，加入过氧化物酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后加入小鼠抗大鼠CD68的第一抗体，4℃冰箱过夜(阴性对照不加一抗)后加入生物素标记的第二抗体，室温下孵育后再加入链霉素抗生物素蛋白．过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。染色过程中均设有阴性对照。ED-1阳性细胞计数定量分析在400倍光镜下进行，每张切片选取其皮质部分，随机计数50个视野ED-1阳性细胞数，计算出ED-1阳性细胞数/视野平均值。免疫组化染色结果按照盲法由一位有经验的病理医师独立进行判断。
5．统计学分析以上实验均在同等条件下重复2次，最终结果取平均值。采用SPSS10.0统计学软件进行分析。实验数据符合正态分布者用均数±标准差表示，正态数据多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD检验，非正态数据两组间比较采用Wileoxon秩和检验，连续型重复测量资料采用重复测量方差分析，α值定为0.05。
实验结果
1．糖尿病模型的建立SD大鼠右肾切除后喂养2周，腹腔内注射STZ 3天后，各个时间点随机血糖均高于16.7mmol/L，非糖尿病组血糖始终在正常范围，与非糖尿病组相比，糖尿病组血糖较高(p<0.05)，第1周至第8周末与非糖尿病组相比，糖尿病组大鼠体重较低(p<0.05)，提示成功建立糖尿病大鼠模型。
2．早期糖尿病肾功能改变的模型观察注射STZ或缓冲液后各组肝功、血脂指标之间差异无统计学意义(p>0.05)。注射STZ或缓冲液前各组24h尿蛋白、尿肌酐之间差异无统计学意义(p>0.05)，糖尿病组注射STZ后24h尿蛋白、尿肌酐较注射STZ前均升高(p<0.05)，糖尿病对照组24h尿蛋白2周时达35.29±13.30mg/24h，8周时达57.94±44.99mg/24h，非糖尿病组注射缓冲液后24h尿蛋白、尿肌酐与注射前比较，差异无统计学意义(p>0.05)。 3．缬沙坦治疗早期糖尿病大鼠后24h尿蛋白、尿肌酐、肌酐清除率变化经缬沙坦治疗后2周，糖尿病治疗组24h尿蛋白、尿肌酐、肌酐清除率与糖尿病对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)；治疗后4周，糖尿病治疗组24h尿蛋白低于糖尿病对照组(27.30±11.95mg/24h，37.17±3.79mg/24h,p<0/05)，尿肌酐、肌酐清除率与糖尿病对照组之间差异无统计学意义(p>0.05)；治疗后8周，糖尿病治疗组24h尿蛋白低于糖尿病对照组(20.52±7.54 mg/24h．57.94±44.99mg/24h，p<0.05)，尿肌酐高于糖尿病对照组(227.85±75.66umol/L56.27±14.26umol/L, p<0.05)，肌酐清除率高于糖尿病对照组(5.91±1.75ml/min，1.13±0.34ml/min，p<0.05)，血肌酐之间差异无统计学意义(30.17±1.33umol/L，36.44±11.81 umol/L,p>0.05)。
经缬沙坦治疗8周与治疗2周及4周相比,8周糖尿病治疗组尿肌酐、肌酐清除率均高(p<0.05)。
缬沙坦对照组应用缬沙坦干预后8周与2周及4周相比，24h尿蛋白、尿肌酐、肌酐清除率之间的差异无统计学意义(p>0.05)。
4．肾脏组织形态学观察(1)光镜显示，非糖尿病组大鼠肾小球、肾小管及间质结构基本正常， 4周时糖尿病对照组表现肾小球轻度增大、肿胀，细胞增多，基底膜增厚，肾小球系膜细胞轻度增生，系膜区增宽，少数肾小球出现轻度硬化，部分肾小管出现细胞空泡变性，无间质纤维化，8周时糖尿病对照组病变较重。糖尿病治疗组较糖尿病对照组病变稍轻，肾小球细胞轻度增多，部分肾小球毛细血管腔狭窄，用PAS染色片做图像分析，各组肾小球平均截面积之间差异无统计学意义(P>0.05)。(2)肾脏超微结构改变：电镜结果显示， 4周开始在糖尿病对照组可见肾小球基底膜不均匀增厚，足突部分脱落、融合，8周时病变较4周时稍重。糖尿病治疗组肾小球基底膜轻度增厚，足突脱落、融合较少。非糖尿病组肾脏结构未见明显异常改变。
5．肾脏巨噬细胞浸润情况非糖尿病组检测到少许CD68阳性的巨噬细胞， 8周糖尿病对照组CD68阳性的巨噬细胞高于正常对照组(11.13±11.99，1.78±0.25，p<0.05)，8周糖尿病治疗组CD68阳性的巨噬细胞低于糖尿病对照组(1.66±1.54，11.13±11.99,p<0.05)。
结论1．采用单侧肾切除、小剂量多次腹腔内注射STZ诱导大鼠，能较早出现肾脏病变。
2．缬沙坦治疗早期糖尿病大鼠后24h尿蛋白较低，肾脏巨噬细胞浸润较少，缬沙坦治疗对早期糖尿病大鼠肾脏有一定的保护作用。