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人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一组嗜黏膜和皮肤上皮的双链环状DNA病毒,其感染靶器官主要为上皮组织,显示高度的宿主特异性,对人体特异部位的上皮细胞具亲和力。HPV感染可以引起皮肤粘膜的良性增生性病变如疣,甚至引起恶性肿瘤的发生。现已鉴定出120余种HPV基因型。现阶段临床治疗上主要采用理化(如冷冻、电灼术、高热激光、化学腐蚀)、细胞毒类药物等创伤性方法治疗疣。由于感染局部免疫缺陷以及缺乏有效的特异性抗病毒制剂和彻底根治的物理方法,导致感染迁延不愈。随着热疗的生理和病理生理学研究逐步深入,以及测温、控温和加温技术的不断进步,热疗得到了迅速的发展。在过去的几十年内,温热曾用于治疗动物和人类多种表浅和深层的良恶性肿瘤。我国传统医学有成功利用灸烤疗法治疗疣的经验。国外有一些临床报告,初步观察到温热对寻常疣、跖疣有较好的治疗效果。我们采用自行研究的远红外加热仪在42-45℃温热条件下照射20-30分钟治疗疣,取得满意的疗效。
有研究认为温热引起病变组织坏死,物理性地去除了HPV病毒,如同其它破坏性物理治疗手段一样,也可能是由于温热直接引起病毒破坏或者是由于炎症反应导致病毒的去除。王晓琴等研究表明温热可促进尖锐湿疣及正常皮肤角质形成细胞的凋亡,并呈温度依赖性,尖锐湿疣角质形成细胞与正常角质形成细胞相比对温热更敏感。细胞介导的免疫应答是HPV感染角质形成细胞清除及疣体消退的主要因素,李晓东等研究表明温热能够促进朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)成熟,促进LC的迁移和增强抗原提呈能力,LC通过真皮向局部淋巴结迁移,在局部细胞免疫应答中发挥作用。
HPV在56℃30分钟的条件下才能灭活,所以温热的作用(39-45℃)并不是对病毒的直接杀灭,但温热是否能抑制HPV的某些活性成分(如E6、E7基因表达)并作为局部温热治疗疣的机制之一,目前尚不清楚。干扰素(Interferon,IFN)家族是在抗病毒过程中诱导的分泌型蛋白,主要分为Ⅰ型IFN(包括IFN-α、-β)与Ⅱ型IFN(IFN-γ),IFN通过与细胞表面的受体结合从而触发JAK-STAT信号途径活化进而诱导下游蛋白酶转录表达,从而发挥抗病毒生物学活性。有研究表明温热能诱导IFN表达增加,Taylor等报道将EB病毒转染的B细胞系置于42℃培养条件下,取上清液进行抗病毒活性检测,发现该上清液极大的提升了Hep-2细胞对抗水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,vsv)感染的能力,经鉴定发现,上清液中发挥抗病毒作用的是IFN-γ。Taylor发现温热诱导IFN表达的现象只存在于转染病毒的细胞系中,而未转染的细胞系经温热处理后未观察到相似现象。温热影响IFN表达和释放的同时,对其生物学活性也产生一定的影响。Payne等报道温热极大地提高了人IFN-α,-β,-γ,及鼠IFN-γ的抗病毒活性。
我们通过检测:1、温热对HPV基因产物表达(E6/E7)的影响;2、温热处理后干扰素及其诱导的下游蛋白酶表达变化;3、温热处理后IFN-α/β受体及其相关JAK-STAT信号途径中信号分子表达变化,探讨温热对HPV感染的抑制及抗病毒免疫活性研究,为临床治疗疣提供稳定、可靠的理论依据。本研究中,我们采用尖锐湿疣组织标本作为病毒载体,利用温热治疗仪进行不同温度照射,采用器官培养的模式,模拟体内环境,开展相关实验,报道如下:
材料与方法
一、材料
临床资料:女性尖锐湿疣(Condyloma acuminatum,CA)患者均为我院皮肤科、妇科门诊患者,符合2000年卫生部防疫司制订的CA诊断标准。
对照组:正常皮肤取自整形术后。
二、标本处理：征得患者知情同意后,局部消毒麻醉,分别切取疣体/正常皮肤组织,每例组织等分为4份。其中一份OTC包埋剂包埋后直接冷冻保存,另3份真皮侧向下,放入少量RPMI-1640培养液,只将疣体底部浸于培养液中分别以37℃、42℃和45℃三种温度照射30分钟后,将疣体全部浸于RPMI-1640培养液,37℃培养箱孵育12小时后将组织取出,OCT包埋剂包埋后冷冻保存。
三、HPV型别鉴定检测：采用TaKaRa公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 DNA纯化试剂盒提取DNA,采用HPV6/11型特异性引物进行PCR扩增,采用1.5％琼脂糖凝胶电泳,紫外凝胶成像系统拍照记录结果。
四、HPV E6/E7 mRNA的检测：采用荧光实时定量PCR方法检测HPV-6 E6/E7,HPV-11 E6/E7 mRNA的表达。按Trnzol试剂说明书提取总RNA;用TIANScript M-MLV试剂盒反转录合成cDNA;SYBR-Green法进行荧光实时定量PCR扩增,采用双标准曲线法进行相对定量分析。
五、干扰素、下游蛋白酶及JAK-STAT途径相关信号分子mRNA的表达：IFN-α、-β、-γ,PKR,OAS1,IFNAR1,IFNAR2,Jak1,Tyk2,Stat1,Stat2mRNA在不同温热条件处理后表达水平变化。方法同三。
六、Western blot检测蛋白表达水平：组织提取总蛋白,BCA法检测蛋白质含量。进行SDS-PAGE电泳,转印至PVDF膜、封闭,PKR,OAS1,p-Stat1,Stat1,p-Stat2,Stat2、β-actin一抗孵育过夜,相应的二抗孵育,增强型化学发光(enhance chemiluminescence,ECL),拍照,以β-actin为内参照,条带进行灰度值分析。
七、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析,数据结果以x±SE表示,以P＜0.05为判断差异显著性标准。组间比较采用方差分析。P＜0.05被认为具有统计学意义。
结果
一、HPV E6/E7 mRNA在温热处理后表达变化E6、E7 mRNA表达均随局部温度升高而逐渐减少。HPV-6 E6 mRNA的相对表达量分别为:37℃(1.00±0.00),42℃(0.61±0.17),45℃(0.27±0.15);HPV-6E7 mRNA的相对表达量分别为:37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相对表达量分别为:37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22),45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相对表达量分别为:37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15),45℃(0.24±0.06)。组间比较有显著性统计学差异(P＜0.001)。
二、温热处理后干扰素及其诱导的下游蛋白酶表达变化温热处理后,CA组织IFN-α、IFN-β、IFN-γ转录水平随温度升高表达明显升高。IFN-α在42℃和45℃温热作用下表达水平与对照组相比分别增加了2-5倍和3-6倍,IFN-β表达水平分别增加了2-4倍和3-4倍,IFN-γ表达水平增加了2-5倍4-14倍。CA组织中感染HPV型别与干扰素诱导水平之间无显著相关性。
OAS1转录水平在42℃和45℃温热作用下表达水平与对照组相比分别增加5倍和11倍左右;其蛋白表达水平在42℃和45℃温热作用下均增加了1-2倍。PKR转录水平在42℃温热作用下表达水平与对照组相比增加3倍,但在45℃条件时表达水平降低了1/3;其蛋白表达水平在42℃和45℃温热作用下均增加了1-2倍。上述指标在正常皮肤组织中未见显著性改变。
三、温热处理后IFN-α/β受体及其相关JAK-STAT信号途径中分子表达变化CA组织中IFNAR1在42℃和45℃温热作用下表达水平与对照组相比分别增加了2-3倍和3-5倍,IFNAR2表达水平则分别增加了2-3倍和2-4倍。Jak1,Tvk2,Stat1和Stat2转录水平在42℃和45℃温热作用下没有发生显著性改变。P-Stat1蛋白表达水平在42℃和45℃温热作用下表达水平与对照组相比均增加了1-2倍(P＜0.001);p-Stat2在42℃和45℃温热作用下表达水平分别增加了1.5倍(P＜0.001)和1.8倍(P＜0.001)。正常皮肤组织在温热作用前后上述指标均未见显著性差异。
结论
1、温热对HPV-6E6、HPV-6E7、HPV-11E6及HPV-11E7 mRNA表达存在抑制作用,表现为这四种基因mRNA表达随着温度的升高而降低。
2、温热能诱导HPV感染组织中三种干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)表达增加,这种诱导作用是呈正相关的,即温度越高,干扰素表达水平越高。CA组织中感染HPV型别与干扰素诱导水平之间无显著相关性。干扰素相关蛋白酶OAS1转录水平及蛋白水平均随着温度的升高而升高,PKR转录水平在45℃时表达有所下降,但蛋白表达水平仍明显升高。干扰素、OAS1及PKR表达上调有利于抑制HPV的复制及播散。温热作用后正常皮肤组织中上述指标未见显著性改变,因此推测温热对干扰素及其相关蛋白酶表达的调节作用可能仅限于病毒感染组织。
3、温热作用后干扰素受体表达上调,而Jak1,Tyk2,Stat1 and Stat2表达水平无明显变化。温热作用后Stat1和Stat2蛋白磷酸化水平上调,而总Stat1和总Stat2表达水平无明显变化。说明温热增强干扰素诱导的抗病毒生物学活性可能同时发生在受体及后续的信号途径水平上。温热作用后正常皮肤组织中上述指标无明显改变。
4、上述结果表明温热可能通过直接抑制HPV活性基因产物表达及增强干扰素诱导的抗病毒生物学活性,从而发挥抗病毒免疫调节作用。