研究背景与目的肺癌是最致命的恶性肿瘤之一,在中国其发病率和死亡率均位于首位,严重威胁人们的生命健康和生活质量,是我国的重大公共卫生问题之一。探索肺癌的发病机理,寻找有效的肺癌筛查和早期诊断的生物标志物,是降低肺癌发病率和死亡率的关键。本研究通过miRNA及lncRNA芯片高通量筛选技术,结合TCGA大数据库及生物信息学分析遴选肺癌相关候选生物标志物;并进一步扩大人群样本量,应用实时荧光定量PCR技术检测并分析miRNA和lncRNA对肺癌发病风险的影响及其诊断价值;最后选取miR-30a-3p、miR-30a-5p及BRE-AS1进一步探索其在肺癌细胞中的生物学功能及可能的调控机制,为进一步了解肺癌的发病机制、筛选肺癌诊断、治疗生物标志物提供理论依据。研究方法1.应用miRNA表达谱芯片技术筛选肺癌组织及癌旁组织中差异表达miRNA,结合TCGA大数据库及生物信息学分析构建miRNA-mRNA表达网络,进一步遴选出肺癌相关miRNA。采用RT-qPCR技术在肺癌人群中对筛选出的差异表达miRNA进行检测,logistic回归分析其异常表达与肺癌发病风险之间的关系,应用ROC曲线下面积评估候选miRNA在肺癌中的诊断价值,采用独立样本t检验分析候选miRNA表达水平与肺癌临床特征之间关系。2.应用lncRNA表达谱芯片技术筛选差异表达lncRNA,结合TCGA大数据库及生物信息学分析构建lncRNA-mRNA表达网络,进一步遴选出肺癌相关lncRNA。在肺癌人群中采用RT-qPCR技术对筛选出的差异表达lncRNA进行检测,logistic回归分析其异常表达与肺癌发病风险之间的关系,应用ROC曲线下面积评估候选lncRNA在肺癌中的诊断价值,采用独立样本t检验分析候选lncRNA表达水平与肺癌临床特征之间关系。3.利用 miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 分别转染 A549 肺癌细胞,构建 miR-30a-3p 和miR-30a-5p过表达细胞模型,应用RT-qPCR技术检测转染后A549细胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p表达情况,确定转染效率。在此基础上进一步分析过表达miR-30a-3p和miR-30a-5p后对肺癌细胞生物学功能的影响及可能调控机制,包括MTT法检测细胞生长增殖、流式细胞术检测细胞周期、Annexin-V FITC & PI双染法检测细胞凋亡。Western Blot检测PI3K-AKT-mTOR通路中关键蛋白水平的表达。4.构建lncRNA BRE-AS1慢病毒过表达载体,转染A549肺癌细胞构建BRE-AS1过表达稳转细胞模型,应用RT-qPCR技术检测稳转后A549细胞中BRE-AS1的表达情况,确定慢病毒转染效率。进一步在此基础上分析过表达BRE-AS1对肺癌细胞的生物学功能的影响及可能调控机制,包括MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期、Annexin-VAPC&7-ADD双染法检测细胞凋亡、细胞划痕实验检测细胞迁移能力。Western Blot检测PI3K-AKT-mTOR通路中关键蛋白水平的表达。研究结果1肺癌相关microRNA的识别1.1肺癌microRNA差异表达谱分析miRNA/mRNA表达谱芯片初步筛选出116个miRNA和502个mRNA表达发生改变。从TCGA数据库筛选出154个差异表达miRNA及5322个差异表达mRNA。二者综合分析,得到交集 miRNA/mRNA 有 29 个及 417 个。应用 starbase V2.0 数据库,TargetScan 及 miRTarbase预测miRNA靶基因,所得结果与芯片及TCGA交集417个mRNA构建miRNA-mRNA表达网络图。应用DIANA-mirPathV.3对29个潜在肺癌相关miRNA进行通路分析,发现这些miRNA 所调控靶基因主要参与 Hippo、TGF-beta、Wnt、ErbB、MAPKsignalingpathway 等环境信息过程信号通路及非小细胞肺癌等人类疾病通路。1.2候选microRNA表达水平与肺癌发病风险及临床特征关系的研究通过RT-qPCR技术在91例人群组织样本中检测6个候选miRNA表达情况,结果显示miR-205-5p 表达显著上调,miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p表达显著下调(p<0.001),与芯片及TCGA数据库所得结果一致。Logistic回归分析显示,miR-205-5p表达水平与肺癌发病风险正相关,增加其表达水平可升高肺癌的发病风险(OR值为 1.287,p<0.01) ; miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p 和 miR-30d-5p 的表达水平与肺癌发病风险负相关,增加其表达水平可降低肺癌发病风险(OR值分别为0.846、0.700、0.585、0.745、0.479, P<0.01)。ROC 特征曲线分析结果显示,miR-205-5p、miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 单独诊断 AUC 分别是 0.728、0.637、0.758、0.772、0.734、0.776 (p<0.001),联合诊断 AUC 为 0.898(p<0. 001),联合诊断敏感度和特异度分别为87.7%和84.9%,提示这些miRNA对肺癌有一定诊断效力、联合诊断效果更佳。独立样本 t 检验分析结果发现,miR-205-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p异常表达水平与肺癌患者病理分型有关(p<0.05),其表达差异在肺鳞癌中显著高于肺腺癌。miR-30a-3p、miR-30c-2-3p异常表达水平与肺癌患者性别有关(p<0.05),其表达差异在男性中显著高于女性。miR-30a-5p、miR-30c-2-3p异常表达水平与肺癌患者的年龄相关(p<0.05),其表达差异在大于50岁患者中显著高于小于50岁患者。提示在不同肺癌病理分型、年龄及性别群体中,miRNA的表达差异不尽相同,即在特定人群中研究miRNA的表达可能对肺癌的诊断、治疗及预后更有意义。2肺癌相关lncRNA的识别2.1肺癌lncRNA差异表达谱分析利用lncRNA表达谱芯片筛选出385个肺癌相关差异表达lncRNA,其中124个表达上调,261个表达下调。从TCGA数据库中筛选出337个肺癌相关差异表达lncRNA,其中191个表达上调,146个表达下调。二者综合分析得11个交集lncRNA,其中表达下调lncRNA有3 个,即 MCTS2P、SCARNA12 与 LOC728554,表达上调lncRNA 有 8 个,即 LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1。基于 11 个候选lncRNA及417个mRNA构建表达网络图。2.2候选lncRNA表达水平与肺癌发病风险及临床特征关系的研究通过RT-qPCR技术在91例肺癌人群组织中检测2个候选lncRNA表达情况,结果显示LINC00312、BRE-AS1均表达下调(p<0.05),与芯片筛选结果及TCGA所得结果一致。Logistic回归分析显示,LINC00312和BRE-AS1表达水平与肺癌发病风险负相关,增加其表达水平可降低肺癌发病风险(OR值分别为0.739和0.362,p<0. 001)。ROC曲线分析结果显示,LINC00312和BRE-AS1单独诊断AUC分别是0.784和0.916 (p<0.05),两者联合诊断AUC为0.922 (p<0.05),两者联合诊断敏感度和特异度分别为87.8%和84.6%,提示联合诊断可提高肺癌诊断效能。独立样本t检验分析结果发现,LINC00312异常表达水平与肺癌患者性别、年龄有关(p<0.05),其表达差异在大于50岁男性患者中显著高于小于50岁女性患者。BRE-AS1异常表达水平与肺癌患者性别、年龄及病理类型有关(P<0.05),其表达差异在大于50岁的男性肺鳞癌患者中显著高于小于50岁的女性肺腺癌患者。提示在不同肺癌病理分型、年龄及性别群体中,lncRNA的表达差异不尽相同,即在特定人群中研究lncRNA的表达可能对肺癌的诊断、治疗及预后更有意义。3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p在肺癌中的生物学功能及机制研究3.1 MiR-30a-3p和miR-30a-5p的生物信息学分析应用DIANA-mirPath 3.0对miR-30a-3p和miR-30a-5p进行生物信息学分析发现,二者与多个肿瘤如Non small cell lung cancer等发生发展密切相关,还参与如PI3K-Akt signaling pathway、Foxo signaling pathway、p53 signaling pathway 等多个肿瘤相关通路的调控。此外,通过 miR-30a-3p 和 miR-30a-5p 潜在靶基因在 Small cell lung cancer 和 Non small cell lung cancer通路上的作用位点,进一步分析发现miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通过对PI3K-Akt通路中相关蛋白的调控,进而影响细胞的增殖和凋亡等生物学过程。3.2 MiR-30a-3p和miR-30a-5p对A549细胞的生物学功能研究miR-30a-3p和miR-30a-5p细胞本底值的RT-qPCR检测结果显示,与16HBE细胞相比,A549细胞中miR-30a-3p和miR-30a-5p均呈低表达状态。与阴性对照组相比,mimic转染组中miR-30a-3p和miR-30a-5p表达水平均显著升高(p<0.05)。MTT法检测细胞增殖结果显示,miR-30a-3p和miR-30a-5pmimic转染组中细胞增殖能力在24h、36h、48h均显著低于阴性对照组(p<0.01),提示在A549细胞中过表达miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制细胞生长。细胞周期结果显示,与阴性对照组相比,miR-30a-3pmimic转染组中细胞S期比例明显增加(p<0.05),提示A549细胞中过表达miR-30a-3p可诱导细胞周期阻滞于S期。细胞凋亡结果显示,与阴性对照组相比,miR-30a-3p和miR-30a-5p mimic转染组中细胞凋亡率显著升高(p<0.05),提示A549细胞中过表达miR-30a-3p和miR-30a-5p可诱导细胞凋亡增加。3.3 MiR-30a-3p和miR-30a-5p对PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白的调控研究对PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白进行Western Blot检测,结果显示,与阴性对照组相比,miR-30a-3pmimic 和 miR-30a-5pmimic 转染组中 AKT3、mTOR、S6K 表达水平明显下降。提示miR-30a-3p和miR-30a-5p可能通过PI3K-AKT3-mTOR通路影响肺癌的发生发展。4 LncRNA BRE-AS1在肺癌中的生物学功能及机制研究4.1慢病毒LncRNABRE-AS1过表达载体构建阳性克隆转化子菌液测序结果与目的基因序列比对分析结果说明测序结果与目标序列完全一致,BRE-AS1过表达慢病毒载体构建成功。4.2 LncRNA BRE-AS1对A549细胞的生物学功能研究慢病毒BRE-AS1过表达转染A549细胞RT-qPCR检测发现,LV-BRE-AS1组中BRE-AS1表达水平是阴性对照组的59.756倍(p<0.05),慢病毒转染效率较好。MTT结果显示LV-BRE-AS1组细胞生长增殖能力明显低于阴性对照组(p<0.05),提示过表达BRE-AS1可抑制A549细胞增殖能力。细胞周期结果显示,与阴性对照组相比,LV-BRE-AS1组细胞S期比例减少,G2/M期比例增加,差异具有统计学意义(p<0.01),提示过表达BRE-AS1可诱导A549细胞阻滞于G2/M期。细胞凋亡结果显示,与阴性对照组相比,LV-BRE-AS1组中晚期及总凋亡比例增加,差异具有统计学意义(p<0.05),提示过表达BRE-AS1可诱导A549细胞凋亡升高。细胞划痕实验结果显示,经慢病毒BRE-AS1过表达稳定转染后肺癌A549细胞迁移能力与阴性对照比较略呈降低趋势,但无统计学意义(p>0.05)。4.3 LncRNA BRE-AS1对PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白的调控研究对PI3K-AKT-mTOR信号通路关键蛋白进行Western Blot检测,结果显示,与阴性对照组相比,LV-BRE-AS1组中PI3K、AKT3、mTOR、S6K及BCL-XL蛋白表达水平明显降低。提示BRE-AS1可能通过对PI3K-AKT3-mTOR信号通路关键蛋白的表达影响参与肺癌的发生发展。研究结论1.本研究通过miRNA芯片、TCGA数据库及miRNA-mRNA表达网络分析,在肺癌组织中筛选出29个差异表达miRNA。人群样本检测发现miR-205-5p在肺癌组织中高表达,与肺癌发病风险呈正相关,miR-27a-5p、miR-30a-3p、miR-30a-5p、miR-30c-2-3p、miR-30d-5p 在肺癌组织中低表达,与肺癌发病风险呈负相关。提示miRNA联合分析可提高肺癌的诊断效能,具有较高的应用价值,在不同性别、年龄及病理类型的特定人群中进一步开展肺癌相关miRNA研究可能更具有实际意义。2.本研究通过lncRNA芯片、TCGA数据库及lncRNA-mRNA表达网络分析,在肺癌组织中筛选出 11 个差异表达 LncRNA:MCTS2P、SCARNA12、LOC728554、LHFPL3-AS2、SFTA1P、LINC00472、GVINP1、BRE-AS1、MIR22HG、LINC00312、MEIS3P1。人群样本检测首次发现LINC00312和BRE-AS1在肺癌组织中低表达,与肺癌发病风险呈负相关。提示lncRNA联合分析可提高肺癌的诊断效能,具有较高的应用价值,在不同性别、年龄及病理类型的特定人群中进一步开展肺癌相关lncRNA研究可能更具有实际意义。3.过表达miR-30a-3p和miR-30a-5p可抑制A549细胞增殖、引起细胞S期周期阻滞,诱导细胞凋亡增加。二者可通过对PI3K-AKT-mTOR信号通路中关键蛋白的表达影响参与肺癌的调控。4.本研究首次研究BRE-AS1在肺癌细胞中的生物学功能及机制,过表达BRE-AS1可抑制A549细胞增殖、改变细胞G2/M周期比例、诱导细胞凋亡增加,BRE-AS1可通过对PI3K-AKT-mTOR信号通路中关键蛋白的表达影响参与肺癌的发生发展。