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蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶,具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶K多用于一些生化实验中,如在核酸提取中,可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交中,蛋白酶K具有降解包围靶DNA蛋白质的作用,可以用来处理杂交前的样本,提高检测的敏感性。现在商业化供应的蛋白酶K主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢,难以高密度培养,蛋白酶K的产量较低。另外,林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶,增加了下游分离纯化的难度。本实验利用毕赤酵母表达系统,实现了蛋白酶K的分泌表达,省去了细胞破碎,DNA沉淀等步骤,提高了产物的回收率。为了提高蛋白酶K的表达量及简化分离纯化工艺,本实验对蛋白酶K密码子进行了优化,将蛋白酶K的密码子都变成了毕赤酵母偏爱的密码子,并在目的基因3’端加上六个组氨酸标签,然后利用人工合成的方法获得目的基因。实验构建了蛋白酶K酵母表达载体,将其导入毕赤酵母GS115中实现了分泌表达,分泌的蛋白酶K可以利用Ni-NTA亲和层析柱进行分离纯化,减少了分离纯化步骤,提高了蛋白酶K的收率。由于发酵条件对产物的表达量有很大影响,实验对诱导温度、pH、诱导剂浓度及诱导时间等条件进行了优化,确定最佳发酵条件。利用优化的条件进行5L发酵罐发酵,并通过测定了菌体生长曲线来确定开始诱导时间。在下游分离纯化中,利用三种方法进行纯化,通过比较这三种纯化方法的酶收率及比活,确定最佳的纯化方法。结果表明,pPIC9K-proteinase K表达载体构建正确,并实现了在毕赤酵母中的分泌表达。通过摇瓶发酵确定的最佳发酵条件为甲醇量0.75%,温度25℃,pH7.0,诱导时间为144h。利用优化的条件进行5L发酵罐发酵,蛋白酶K表达量可以达到2.2g/L,比目前现有蛋白酶K工业生产方法的产率(0.3-0.5g/L发酵液)高4-7倍。最后,通过比较三种纯化方法的酶收率及比活,可以看出,将去菌体后的发酵液直接通过Ni-NTA亲和层析柱层析可以得到较好的纯化效果,无需对去菌体后的发酵液进行前期处理,回收率可以达到84%,酶的比活为175U/mg。