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肝细胞是肝脏的主体细胞,占肝内细胞的70%,易受到各种致病因子的损伤,其中缺氧既是肝细胞损伤的源头因素,也是其他致病因子损伤肝细胞的帮凶。氧化应激是肝细胞损伤的关键机制,受损肝细胞释放大量的促炎和促纤维化因子,活化肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs),导致细胞外基质的异常沉积,同时基质降解减少。前期研究发现联合干预肝细胞内氧和氧化应激感受器,可抑制肝星状细胞活化、减少胶原产生,延缓肝脏纤维化的发展;但与基质降解相关的基质金属蛋白酶是否同时发生变化尚不清楚。本实验探究了缺氧状况下,干预肝细胞内氧化应激感受器后,对肝星状细胞基质金属蛋白酶-2以及酶活性调控相关分子的影响。目的建立敲低肝细胞内氧化应激感受器Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)的干预模型,探讨下调Keap1的缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性及调控分子如基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP-2)、膜型基质金属蛋白酶-1(membrane-type 1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP或MMP14)、小窝蛋白(caveolin-1,Cav-1)等的影响。方法根据本组建立的方法,构建Keap1sh RNA质粒载体,荧光显微镜观察肝细胞中转染效率。缺氧培养Keap1下调的肝细胞,通过Western Blot、Q-PCR验证Keap1下调后的肝细胞模型中Keap1及其下游分子Nrf2等蛋白的表达水平。利用上述肝细胞培养上清干预小鼠肝星状细胞株(HSC-T6),通过Western Blot检测小鼠HSC-T6的MMP-2、caveolin-1、MT1-MMP、TNF-α、TIMP-2蛋白表达。明胶酶谱法检测上清中MMP-2活性。最后用TNF-α表达抑制剂来那度胺处理缺氧肝细胞,检测相关指标,初步探讨可能机制。每项实验独立重复3次,数据由均值±标准差(mean±SD)表示,采用单因素方差分析实验数据。结果成功建立Keap1下调的稳转肝细胞株,敲低肝细胞内的氧化应激感受器Keap1之后,对肝细胞具有保护作用的Nrf2表达增高,而促炎介质TNF-α的表达减少。敲低Keap1的肝细胞上清能明显影响肝星状细胞的MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP、caveolin-1蛋白的表达。Keap1下调的肝细胞行缺氧培养,收集其上清(CM)培养HSC-T6细胞,与单纯的DMEM组相比,肝细胞的CM使HSC-T6细胞MMP-2、caveolin-1、MT1-MMP、TIMP-2蛋白表达减少而MMP-2的活性增高。经TNF-α抑制剂处理的缺氧肝细胞上清使肝星状细胞TNF-α表达减少,MMP-2的活性升高。以上差异均具有统计学意义。结论缺氧肝细胞氧化应激感受器Keap1下调,抗氧化应激分子Nrf2水平升高,肝细胞损伤程度减轻,合成及释放TNF-α减少,可能对肝星状细胞内吞相关分子caveolin-1表达的刺激作用降低,减轻了对膜表面的MMP-2活化的干扰,MMP-2活性得以升高。