论文部分内容阅读
目的：本研究旨在探索BNP治疗心力衰竭的新途径。通过构建重组腺病毒Ad-hBNP，制备CHF大鼠模型，观察外源基因hBNP导入动物机体后在动物体内的分布及表达，探讨BNP对CHF治疗作用及其机制，为今后BNP基因治疗的临床应用提供基础研究的理论依据。方法：1．构建重组腺病毒Ad-hBNP RT-PCR方法从人心肌组织获得hBNP片段，与pUCm-T载体连接构成pUC-hBNP重组质粒；KpnⅠ、SalⅠ分别双酶切pUC-hBNP和pAdTrack-CMV，将目的片段插入pAdTrack-CMV构建pAdTrack-hBNP重组质粒；pAdTrack-hBNP重组质粒经PmeⅠ酶切线性化后，电转法转入含有腺病毒骨架质粒的E．coilBJ5183感受态细胞中，同源重组获得重组质粒pAdEasy-hBNP；经BamHI、PacⅠ酶切鉴定及基因序列检测后，重组成功的pAdEasy-hBNP经阳离子脂质体法转染293T细胞，经过包装、扩增和纯化后，获得可用于实验性基因治疗的重组腺病毒Ad-hBNP。2．制备CHF大鼠模型采用腹主动脉缩窄法制备CHF大鼠模型。于右肾动脉分支处上方缩窄腹主动脉至0．6mm，同时设立假手术组及正常对照组。12周后行超声心动图及血液动力学检测心脏结构和功能、放射免疫分析测定血清AgⅡ和Ald水平、HE染色及Masson染色检测心肌病理学变化、RT-PCR分析心肌胶原mRNA表达，综合评价CHF大鼠心功能。确定动物实验CHF大鼠入选标准。3．研究重组腺病毒Ad-hBNP对CHF大鼠的治疗作用（1）观察CHF大鼠接受Ad-hBNP治疗后，hBNP在体内的分布与表达CHF大鼠24只，18只单次腹腔注射重组腺病毒Ad-hBNP后，随机均分为1天组、4天组和7天组；另6只CHF大鼠不予以重组腺病毒，记为0点组。各实验组动物于相应的时间处死，ELISA检测血清hBNP水平，免疫组化检测CHF大鼠各脏器hBNP的表达，RT-PCR检测各组织hBNP mRNA的表达。（2）观察Ad-hBNP对CHF大鼠的治疗效果30只CHF大鼠，随机分为Ad-hBNP组、Ad-Track组、NS组，另设假手术组不予任何治疗作为对照组，分别经腹腔注射予以相应治疗，每周一次，共4周。4周后实验动物行超声心动图及血液动力学检测，ELISA检测血清hBNP水平，放射免疫分析测定血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α含量，RT-PCR分析心肌胶原mRNA表达水平。结果：1．应用Ad-Easy缺陷性腺病毒载体系统成功构建重组腺病毒Ad-hBNP，纯化后Ad-hBNP病毒滴度达到4．4275×1012VP／ml。透射电镜观察Ad-hBNP呈多面体结构，颗粒直径在90nm左右。2．腹主动脉缩窄术12周后，经超声心动图和血液动力学检测、神经内分泌指标、病理学及RT-PCR测定心肌胶原mRNA表达等多种途径，并结合临床表现综合评价，证实CHF动物模型造模成功。确定在体动物实验CHF大鼠的入选标准：（1）大鼠腹主动脉结扎术后12周，出现进食量减少，精神萎靡，少活动，被毛无光泽、蓬松。（2）超声心动图检测指标：LVESD＞0．32cm、VLEDD＞0．65cm，EF＜75％，FS＜40％。3．单次腹腔注射Ad-hBNP，CHF大鼠心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏及小肠均检测到hBNP表达，外源性hBNP在CHF大鼠体内的表达至少可持续7天。4．间断重组腺病毒Ad-hBNP治疗，CHF大鼠IVS、LVEDD、LVESD、LVPW显著降低，而EF、FS显著增高；同时CHF大鼠心功能明显改善，表现为HR显著降低，LVSP和+dP／dtmax显著升高及LVEDP降低和-dP／dtmax绝对值升高。5．与Ad-Track组及NS组比较，Ad-hBNP组血清AgⅡ、Ald、ET及TNF-α水平较明显下降；心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达显著降低。结论：1．应用Ad-Easy缺陷性腺病毒载体系统可成功构建重组腺病毒Ad-hBNP。2．利用腹主动脉缩窄术可成功制备CHF大鼠模型。3．单次腹腔注射Ad-hBNP，外源hBNP基因可在CHF大鼠多脏器中得到有效表达，其生物学效应时间显著长于BNP的生物半衰期。4．间断给予Ad-hBNP能够有效地改善CHF大鼠心脏结构、功能及心室重构。BNP可能在抑制循环或局部神经内分泌—细胞因子水平发挥作用，对抗心室重构。应用BNP治疗CHF是否有益目前尚存争议，本研究就此问题得出了初步结果，认为BNP基因治疗心力衰竭是一种新的尝试，为开展BNP基因治疗临床应用提供了基础研究的理论参考。目前国内外尚无BNP基因治疗CHF的相关报道。