脑卒中是世界上除缺血性心脏病之外的第二大死亡原因。脑卒中在不同国家之间的发病率有所不同,并且随着年龄的增长,脑卒中的发生率也不断增加。在脑缺血发生时,动脉供应的中心区域会产生低灌注,随后在其周围区域逐渐出现由于代谢和离子紊乱所引起的功能丧失但脑组织结构仍然保持完整的缺血半暗带。只要能够及时地恢复缺血半暗带的血流再灌注,可以大大减少脑缺血所导致的功能损伤。大量的动物实验和临床病人的研究资料均表明,急性脑缺血发生后能诱导缺血区及其周围区血管保护性增生,新生血管能够增加缺血半暗区氧气和营养物质的供应,从而促进神经功能的恢复；然而,脑缺血后自体内源性促血管增殖因子表达量往往不足以诱导有效的代偿性微循环重建。因此,应用外源性促血管生成因子促进微血管增生治疗脑缺血的实验研究在近年来逐渐成为了研究热点之一。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最强的,也是在脑缺血实验中应用最多的促血管生成因子。在急性脑缺血发生后,VEGF在脑内呈现出上调表达,其不但具有促进血管内皮细胞增殖和促进新生血管形成的作用,而且还具有直接的神经营养、神经保护以及抗神经细胞和神经前体细胞凋亡等多种作用,是治疗脑缺血等缺血性疾病颇具前景的细胞因子。但是由于血脑屏障(BBB)的存在,其可以阻挡大分子非脂质物质进入脑内,目前的研究还只是局限于通过病毒载体携带VEGF基因,通过颅内侧脑室或者脑实质注射的方式使外源基因在脑内有所表达。这样不仅是一种有创的治疗方式,而且由于使用病毒作为载体,很容易出现病毒基因与宿主基因整合从而导致一系列的副作用。因此探索一种非病毒的基因载体,能够通过静脉注射的方式实现外源基因跨BBB在脑内的广泛性表达,成为一个新的研究方向。目的第一部分构建一种高效的可以携带外源基因通过静脉注射的方式,透过血脑屏障进入脑内特异性表达目的蛋白的非病毒载体。第二部分比较不同剂量的脂质体(PEGylated liposomes, PLs),脑靶向脂质体(Transferrin targeted PLs, Tf-pCMV-PLs)和脑内GFAP启动子启动的特异性表达的脑靶向脂质体Tf-pGFAP-PLs经尾静脉注射后,在脑内及周围组织的表达情况。第三部分比较有Tf靶向和无Tf靶向的脂质体在包裹VEGF治疗基因后,治疗大鼠脑缺血的疗效。方法第一部分通过不同比例的配比,对脂质体合成过程中油相种类和油水比例、磷脂和胆固醇比例、旋转蒸发温度、超声温度和时间进行筛选化,并且通过试剂盒检测脂质体的包封率和Tf偶联率。将合成好的包裹LacZ基因的脑靶向脂质体(Tf-pCMV-PLs)经尾静脉注射至大鼠体内,通过组织化学染色检测LacZ基因在大鼠体内的表达情况,验证合成的Tf-pCMV-PLs是否可以转运外源基因跨过血脑屏障进入脑内表达。第二部分将PLs低剂量组(共包含80μg pCMV-LacZ质粒)、PLs高剂量组(共包含300μg pCMV-LacZ质粒)、Tf-pCMV-PLs组(共包含80μg pCMV-LacZ质粒)、Tf-pGFAP-PLs组(共包含80μg pGFAP-LacZ质粒)和空白脂质体组分别通过尾静脉注射到大鼠体内,24 h后行RT-PCR检测脑及周围组织LacZ基因mRNA的表达情况,48 h后通过β-半乳糖苷酶检测试剂盒检测脑及周围组织β-半乳糖苷酶活性,通过组织化学染色的方法检测β-半乳糖苷酶在脑及周围组织的分布情况,并且对脑及周围组织进行HE染色评估脂质体的毒性作用。第三部分制作pMCAO模型后2 d,将108只大鼠随机分为3组,每组36只分别注射Tf-VEGF-PLs, VEGF-PLs和生理盐水。Tf-LacZ-PLs同时被注射到大鼠模型体内作为VEGF成功转入脑内的提示。注射脂质体24 h后,行RT-PCR检测不同组脑内VEGF基因mRNA的情况,48h后通过Western Blot检测不同组脑内VEGF蛋白的表达情况,并分别在大鼠脑缺血后1、7、14和21 d根据mNSS量表进行神经功能评分。大鼠脑缺血后第21d,取脑组织进行TTC染色计算不同组间的脑梗死面积；注射5%FITC-葡聚糖溶液,脑组织冰冻切片后荧光显微镜下行微血管密度计数,比较不同治疗组间血管再生情况；21d时多普勒超声检测不同组间脑血流的情况,与脑缺血前脑血流量相比后,根据百分比的高低来评估不同治疗组微血管再生后,是否对脑血流的改变产生影响。结果第一部分脂质体合成的最佳比例为磷脂：胆固醇为1：1；脂药比为100：1；油相种类为二氯甲烷；油水比例为4：1；旋蒸温度为30℃；超声温度为10℃；超声时间为5min,10%的海藻糖可以增加脂质体的稳定性。测得的脂质体的包封率为87.24%,Tf偶联率为69%。将Tf-pCMV-PLs通过尾静脉注射到大鼠体内后可以观察到LacZ基因在脑内及周围器官的表达。第二部分药物注射24 h后,在大鼠脑中,PLs高剂量组、Tf-pCMV-PLs组和Tf-pGFAP-PLs组均可检测到不同水平的LacZ mRNA。但是在周围组织中,包括心肝脾肾肺,只有Tf-pGFAP-PLs组未检测到LacZ mRNA。组织化学染色结果表明Tf-pGFAP-PLs可以实现外源性LacZ基因脑内的弥漫性表达,而HE染色结果说明Tf-pGFAP-PLs对大鼠脑及周围组织无明显毒性作用。第三部分24 h后VEGF基因mRNA和48h后VEGF蛋白的表达量,Tf-VEGF-PLs组显著高于VEGF-PLs组和生理盐水对照组。随着时间的推移,在脑缺血21d后,Tf-VEGF-PLs组脑缺血大鼠的mNSS评分有显著性提高,TTC染色脑梗死面积明显小于对照组,微血管密度计数显著高于对照组,同时局部脑血流量显著高于对照组。结论第一部分通过工艺优化可以合成携带外源基因的转铁蛋白靶向脂质体(Tf-pCMV-PLs),其可以通过静脉系统跨过血脑屏障进入脑内进行表达,为实现颅内疾病的基因治疗奠定了基础。但是外源基因的启动子仍然需要进一步地改进,减少外源基因在周围器官的非特异性表达。第二部分Tf-pGFAP-PLs组可以实现外源性LacZ跨血脑屏障的脑内特异性弥漫性表达,避免了外周组织的非特异性表达,是一种较好的外源基因脑靶向的载体,为实现颅内疾病的基因治疗奠定了实验基础。第三部分Tf-VEGF-PLs可以增加脑缺血大鼠脑内VEGF的表达量,明显的改善神经功能活动,促进新生血管再生,增加局部脑血流量,减少脑缺血面积,是一种有效地治疗大鼠脑缺血的方法。