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结核病主要由结核分枝杆菌感染引起,并严重威胁人类的健康。我国是世界结核病发生五大高负担国之一。结核病控制的难点主要表现为:现有疫苗BCG对成人的保护能力低下;缺乏快速准确的诊断方法;结核分枝杆菌不断出现的耐药以及结核病患者和国家巨大的经济负担。筛选新型特异性免疫应答抗原对结核病的诊断和亚单位疫苗开发具有重要意义。本研究第一部分利用基因工程学方法,构建了大量荷载结核分枝杆菌基因的原核表达质粒,通过体外表达纯化获得了40多种与结核分枝杆菌毒性、潜伏感染或代谢等相关的融合蛋白。进一步用ELISPOT方法体外检测活动期结核病患者抗原特异性γ-干扰素(IFN-γ)的分泌。从中筛选出了27种能引起活动性结核病人强免疫反应的抗原。其中Rv3119,Rv0733,Rv0432,Rv3006,Rv3914,Rv1908c,Rv0899和Rv1411c等8种抗原通过体外激活特异性促进IFN-γ的释放,从而具有应用于结核病诊断价值为本研究首次发现。进一步分析不同的临床症状病人对上述筛选获得的8种高免疫应答性的结核分枝杆菌抗原,发现肺结核耐药患者或结核性胸膜炎患者对Rv0899反应强度显著高于单纯肺结核即仅有肺部实质病变的结核病患者;而支气管结核病人对Rv0899,Rv0432,Rv1411c,Rv0733和Rv3006等5种抗原的反应强度显著高于单纯肺结核病人。通过对结核病临床治疗患者的跟踪分析,发现结核患者对Rv0733和Rv3006的特异性应答强度在治疗1个月后呈现显著下降趋势,提示不同治疗阶段的病人对上述两种抗原的反应性随着疾病的缓解而降低。最新研究表明,结核潜伏感染时期的免疫应答阳性抗原是较有开发前途的亚单位疫苗候选分子。本研究所筛选出的高应答抗原分子中,Rv0733和Rv3006能诱导潜伏感染者强烈的IFN-γ反应。另据报道Rv0733具有很高的MHC I和MHC II亲和力,而Rv3006能诱导很强的抗体反应。因而,检测Rv0733和Rv3006联合使用作为亚单位疫苗的价值,具有重要意义。将Rv0733和Rv3006抗原免疫C57BL/6小鼠后,两者既能诱导抗原特异性IFN-γ反应,也能引起强烈的特异性抗体反应。C57BL/6小鼠经Rv0733和Rv3006抗原免疫后,再行H37Rv结核分枝杆菌感染后,其脾脏H37Rv菌落数显著低于阴性对照组,而与BCG免疫组无显著差异。由此可见,Rv0733和Rv3006联合使用对小鼠具有很好的保护,是可用于亚单位疫苗开发的新型抗原候选分子。因此,上述研究结果表明我们筛选获得的新型免疫应答阳性的抗原分子具有良好的结核病诊断和亚单位疫苗开发前景。目前结核分枝杆菌感染的免疫学诊断主要依赖于IFN-γ释放实验,常用商用试剂盒为T-SPOT.TB和QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-IT)。但是这二种试剂盒都无法区分结核潜伏感染者与活动性结核病人,而且IFN-γ的表达量低,易产生较多的不确定值。新型抗原特异性细胞因子或趋化因子以替代或与IFN-γ联合使用,有助于提高结核分枝杆菌感染诊断的敏感性和特异性。本研究第二部分以T-SPOT.TB和QFT-IT共同使用的抗原ESAT-6和CFP-10的多肽混合物(E6C10P)为模式抗原,用Luminex多因子检测法检测了外周血单个核细胞(PBMC)经E6C10P刺激20 h后培养上清中22种抗原特异性细胞因子或趋化因子的分泌量。统计学分析表明,结核病人外周血经E6C10P抗原特异性刺激后,所分泌的细胞因子或趋化因子包括IFN-γ,MIG,IL-2,IFN-α2和IP-10等的量显著高于正常对照人群(P<0.01)。在潜伏感染者中,其E6C10P抗原特异性IFN-γ,MIG,IL-2,IFN-α2和IP-10的分泌趋势与活动性结核病人基本一致,均显著高于正常对照人群。ROC曲线分析发现,E6C10P抗原特异性IFN-γ,MIG,IL-2和IFN-α2具有良好的活动性结核和潜伏感染的诊断价值,其中E6C10P抗原特异性IFN-α2在结核病患者中的显著增高,并具有潜在的结核诊断价值为本研究首次发现。对于上述抗原特异性高分泌的IFN-γ,MIG,IL-2,IFN-α2和IP-10的细胞学机制,本研究利用T细胞去除实验证明,E6C10P抗原特异性IL-2和IP-10是T细胞完全依赖的,而IFN-γ,MIG和IFN-α2为T细胞部分依赖。虽然E6C10P抗原特异性高水平的IP-10的分泌依赖于T细胞,但是T细胞并不大量表达IP-10。胞内细胞因子染色实验发现E6C10P抗原特异性IP-10主要由CD14~+单核细胞分泌。取最大似然比时的检测阈值为945.2 pg/ml,E6C10P抗原特异性IP-10在活动性结核病诊断敏感性和特异性分别为95.45%和99.12%,表明IP-10具有良好的临床诊断价值;同时,随着抗结核特异性治疗的进行,患者E6C10P抗原特异性IP-10分泌量显著下降至945.2 pg/ml以下,提示E6C10P抗原特异性IP-10同时具有良好的临床预后价值。有意思的是,本研究首次发现71.8%的潜伏感染者E6C10P抗原特异性IP-10的分泌量低于945.2 pg/ml。由于IFN-γ释放实验如,T-SPOT.TB,ELISPOT或QFT-IT可同时检测出结核潜伏感染和活动性结核病患者,因此,联合E6C10P抗原特异性分泌的IFN-γ和IP-10实验,能将71.8%的潜伏感染者与活动性结核病人区分开来,有助于增加活动性结核病人诊断的特异性。综上所述,本研究通过IFN-γ释放实验,筛选获得了8种具有良好诊断价值的新型免疫应答高反应性抗原,经小鼠实验发现潜伏感染相关抗原Rv0733和Rv3006可在小鼠体内诱导强的免疫应答和初步免疫保护作用,表明上述两个蛋白作为亚单位疫苗候选分子值得进一步深入研究;同时为了寻找抗原特异性IFN-γ以外的细胞因子用于结核病的免疫诊断,结合体外抗原特异性刺激和Luminex筛查手段发现抗原特异性MIG,IL-2,IFN-α2和IP-10作为新的细胞因子候选分子在结核分枝杆菌感染诊断中具有潜在价值。并进一步证明特异性抗原刺激后的单核细胞分泌IP-10为T细胞依赖性,其在潜伏感染人群中的低水平分泌为区分潜伏感染和活动性患者提供新的诊断和临床预后生物标志物。