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腱-骨愈合(tendon-bone healing)是运动医学与骨科面临的主要科学问题之一。肩袖止点断裂后局部应用生物学制剂(如细胞成分,细胞外基质或各种生长因子)可有效增加手术修复的成功率,改善修复术后的长期疗效。然而,生物力学结果表明,生物学制剂并不能真正提高肩袖修补的生物力学。如何更好地解决腱-骨愈合问题,成为运动医学面临的热点、难点。以往的研究表明,生长因子如骨形态发生蛋白2、7(BMP-2、BMP-7),转化生长因子β1和β3(TGF-β1、TGF-β3),碱性成纤维细胞生长因子(FGF)等有效提高动物模型中腱-骨愈合的治愈率。由于过分强调骨侧“被动”愈合,修复后生物力学强度并未见明显增加,应用此类因子提高手术成功率的结论存在质疑。最近的研究表明,早期生长反应因子(early growth response-1,Egr1)参与了肌腱分化。EGR1不仅促进胚胎时期四肢肌腱细胞的分化,并且能诱导肌腱形成标志物Scleraxis(SCX)的表达和肌腱胶原的形成。体内研究进一步证实,过表达Egr1的间充值干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对损伤跟腱有明显的修复作用。前期课题组大量研究发现,肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)是修复肌腱损伤最有效的前体细胞之一。如何刺激TSCs向肌腱方向分化,进而促进腱侧“主动”愈合成为本课题主要重点。本部分拟观察EGR1诱导TSC细胞向肌腱分化的作用。本研究拟从EGR1对TSCs分化作用的影响,观察影响TSCs成肌腱分化的信号通路,最后将EGR1导入TSCs,观察EGR1-TSCs对腱-骨愈合影响的表现。第一部分EGR1对TSCs多向分化影响的初步观察本部分拟观察EGR1对TSCs的多向分化能力的观察,对比成肌腱分化与病理性分化的差异。一、实验方法双酶切法将EGR1 c DNA编码序列从pCMV-EGR1切除,回收后并进一步克隆至pcDNA3.1+载体上,获得pCDNA-EGR1。细胞转染pCDNA-EGR1或载体(对照)单独使用Lipofectamine 2000转染试剂。G418(800μg/ml)筛选稳定转染细胞。TSCs与pCDNA-EGR1转染TSCs(EGR1-TSCS)进行向肌腱方向培养培养,细胞接种于含有DMEM的6孔板中。采用免疫荧光染色和荧光定量PCR检测,对分化相关的基因SCX、TNMD、TNC、Col I表达的检测。二、实验结果免疫荧光染色显示:过表达EGR1的TSCs可以表达较高水平的肌腱标记物SCX、TNMD与TNC,表明EGR1基因影响这些细胞腱性分化相关基因的转录水平。细胞特殊染色显示,过表达EGR1的TSCs诱导分化抑制成脂肪分化、成骨分化、成软骨分化。此外,PPARγ、Runx2、Sox9基因转录水平下降,表明EGR1下调非腱性分化(成脂、成骨、成软骨等)相关基因的转录。三、小结1.将EGR1转染至TSCs后,获得过表达EGR1的稳定TSCs细胞株。2.从蛋白表达、基因转录水平检测显示,EGR1促进TSCs向成肌腱方向分化。3.EGR1特异性促进TSCs向成肌腱分化,同时抑制TSCs向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞方向分化。第二部分EGR1对TSCs向成肌腱方向分化的通路研究本部分在第一部分研究基础上进一步研究EGR1影响TSCs成肌腱分化的信号通路。一、实验方法在成肌腱分化研究过程中,分析BMP12/Smad1/5/8通路蛋白的产量,两组在不同时间点收集细胞。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度与等量的蛋白质,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜,依次用第一和第二抗体阻断。使用LICOR Odyssey成像仪观察结果。二、实验结果在EGR1-TSCs组,BMP12基因m RNA和蛋白水平和p-Smad1/5/8蛋白水平相似,逐渐增加并呈时间依赖性过表达,并促进向成肌腱分化,但在TSCs组中并不明显。肌腱分化中Smad1蛋白水平总量没有增加。EGR1-TSCS组肌腱相关基因的表达,SCX、TNMD、TNC、Col I呈时间依赖性逐渐增加。三、小结1.BMP12能诱导TSC向成肌腱分化,并得出最优剂量及最优持续时间。2.BMP12与BMPRI型受体结合后激活Smad表达,EGR1通过BMP12/Smad1/5/8信号通路促进TSCs向成肌腱分化。3.EGR1-TSCs向成肌腱分化过程中,EGR1对BMP12、Smad1/5/8调节呈时间依赖性。第三部分过表达EGR1的TSCs对兔肩袖慢性损伤的影响本部分建立兔肩袖慢性损伤模型,将EGR1-TSCs植入腱-骨界面,观察对腱-骨愈合的影响。一、实验方法将24只成年新西兰大白兔的双侧冈上肌腱切断,右侧为实验组,左侧假手术组。6周后行肩袖陈旧性损伤修补术。TSCs与EGR1-TSCS混合纤维蛋白胶中植入肩袖界面间。将实验用兔分为三组:1组(R),修复手术;2组(TSCs),修补+植入含TSCs的纤维蛋白胶;3组(EGR1-TSCS),修复+植入含EGR1-TSCS的纤维蛋白胶。修复手术8周后处死所有兔。组织学分析和免疫组化检测评估之间的差异。二、实验结果术后8周,TSCs组呈平行的纤维组织,可见沿应力方向少量的Sharpey纤维;在EGR1-TSC组,胶原纤维排列更为有序,止点处Sharpey纤维较TSC组更明显。三、小结1.通过建立稳定的兔肩袖慢性损伤模型,为腱-骨愈合提供了良好的动物模型。2.在兔肩袖慢性损伤模型中,腱-骨界面应用含有EGR1-TSCs的纤维凝胶可有效促进腱-骨愈合。