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前言肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,也是全球恶性肿瘤致死的首要因素。据报道,目前我国肺癌发病率每年增长26.9%。因此,加强以肺癌分子生物学等领域为基础的肺癌病因学研究,从而探讨其发病机理及治疗方法具有极其重要的意义。BAMBI(BMP and activin membrane-bound inhibitor)基因定位在10号染色体p12.3-p11.2区域,编码产物为一个由260个氨基酸组成的跨膜糖蛋白,分子量29108道尔顿,又称作伪受体(pseudoreceptor)、NMA(non-metastatic gene A protein),属于BAMBI家族。该家族成员与转化生长因子-β(the transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、激活素(activin)等配体的Ⅰ型受体胞外区都具有相似的结构。因此BAMBI能够整合到配体.受体复合物中,并与TGF-βⅡ型受体形成聚合物,但由于它不具有TGF-βⅠ型受体所特有的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,所以不能磷酸化胞浆内的Smad蛋白,从而在受体水平上阻滞TGF-β信号转导。有研究表明,对于肺癌等上皮组织来源的肿瘤而言,TGF-β可以抑制肿瘤细胞的增殖,而BAMBI在TGF-β信号通路中的负调节机制对肺癌的作用目前尚不清楚。另外,据报道BAMBI在人结肠癌、肝癌中均存在表达上调,但在非小细胞肺癌中的表达尚未明确。目的检测BAMBI在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达情况,探讨其与NSCLC临床病理因素之间的关系;同时观察BAMBI在非小细胞肺癌细胞系中的表达分布情况,并探讨其表达与NSCLC病理分型及侵袭潜能之间的关系。实验材料与方法一、非小细胞肺癌组织及细胞系63例NSCLC及癌旁正常组织标本用于免疫组织化学检测。其中31例新鲜肺癌组织及癌旁正常肺组织标本,术后立即投入液氮速冻之后,于-70℃保存,用于RT-PCR检测。三株NSCLC细胞系包括人肺腺癌细胞系A549、人肺巨细胞癌高侵袭潜能的亚系BE1以及人肺巨细胞癌低侵袭潜能的亚系LH7用于免疫荧光技术、RT-PCR以及Western blot检测。二、半定量RT-PCR用RNAout提取总RNA,合成BAMBI、GAPDH引物,应用两步法RT-PCR试剂盒合成cDNA链,然后进行PCR扩增。产物经2%琼脂糖凝胶电泳,用自动电泳凝胶成像分析系统采集图像,测定条带积分光密度值。三、免疫组织化学染色组织经多聚甲醛固定,制成石蜡切片进行免疫组化SP法染色,一抗1:200稀释,DAB显色,苏木精复染,中性树胶封片。用显微镜观察采集图像。四、细胞培养A549细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基;BE1及LH7细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。所有细胞都在37℃、5%CO2条件下孵育。五、Western blot检测离心收集细胞,加入适量裂解液,离心取上清。蛋白定量后电泳、转膜,封闭后加入一抗(1:1000)4℃过夜。次日加入二抗(1:10000)常温2h,加入ECL试剂暗室曝光,用自动电泳凝胶成像分析系统采集图像,测定条带积分光密度值。六、免疫细胞荧光染色细胞爬片,用多聚甲醛固定,封闭后加入一抗(1:200)4℃过夜,次日加入FITC标记的二抗(1:100)室温2h,PI(1:1000)核复染,封片。应用激光共聚焦扫描显微镜系统观察采集图像。结果BAMBImRNA在癌旁组织中有较弱的表达,其在癌组织中的表达高于相应的癌旁组织(0.358±0.135vs0.249±0.129),两者差异具有显著性意义(P=0.003)。BAMBI蛋白主要表达在胞膜和靠近胞膜的胞浆,其在癌组织中的表达高于癌旁组织,两者差异具有显著性意义(P<0.01)。BAMBI mRNA在A549中的表达低于BE1及LH7(0.574±0.035,0.731±0.051,0.734±0.049)。分别比较,差异具有显著性意义(P<0.001)。BE1、LH7中BAMBImRNA表达差异无显著性意义(P=0.216)。A549及BE1、LH7中BAMBI蛋白相对含量分别为0.769±0.103,0.963±0.061,0.957±0.048。A549中蛋白表达显著低于BE1、LH7(P<0.001),而BE1和LH7之间的差异无显著性意义(P=0.096)。BAMBI在A549细胞膜上的染色强度较弱,且呈现颗粒状不均一性;BE1、LH7胞膜的染色较强,连续且均匀一致。结论BAMBI的异常高表达与NSCLC的发生有关,其在肺鳞癌中的表达低于肺腺癌,在肺巨细胞癌中的表达高于肺腺癌,且其表达高低可能与肺巨细胞癌的侵袭潜能无关。