研究背景和目的肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是最常见的肾癌类型,约占成人恶性肿瘤的2-3%。虽然局限性ccRCC的5年生存率为65%,但转移性ccRCC的5生存率不到10%。近些年的研究发现表观遗传学调控在ccRCC的发展中起着重要的调节作用。在本研究中,我们发现microRNA-335（miR-335）和N6-腺苷酸甲基化（m6A）转移酶METTL14通过不同表观遗传学途径调控Hippo信号通路进而影响ccRCC细胞的增殖、侵袭和迁移。一方面,我们的研究证实H3K9me1/2组蛋白去甲基酶KDM3A是一个新的miR-335调控靶基因,KDM3A在ccRCC中高表达,其上调参与了 ccRCC进展。同时我们发现Hippo信号通路的核心分子YAP1为KDM3A的直接下游靶点,CHIP-qPCR证实了KDM3A在YAP1启动子上的富集,通过实验探究了 miR-335/KDM3A/YAP1信号轴在ccRCC进展过程中的机制。另一方面,我们发现在ccRCC中m6A水平显著降低,METTL14低表达与预后不良显著相关。通过一系列IP实验证实了METTL14通过m6A依赖的方式增强Hippo信号通路中关键分子LATS1 mRNA的稳定性,进而参与调控Hippo信号通路,在ccRCC进展过程中发挥重要功能更。总之,我们的研究发现了 miR-335和METTL14通过不同表观遗传学途径调控Hippo信号通路进而影响ccRCC进展的机制,为ccRCC的发生发展研究提供了新的思路和潜在的治疗新靶点。方法和结果1.通过生信分析发现miR-335在ccRCC中低表达,CCK8、transwell及划痕实验果提示过表达miR-335抑制了 786-O细胞的增殖、侵袭和迁移能力;2.通过数据库靶向双荧光素酶报告实验发现KDM3A是miR-335的靶基因,过表达miR-335时可在RNA和蛋白质水平抑制KDM3A的表达;细胞功能实验结果表明过表达KDM3A时可以增强786-O细胞的增殖、侵袭和迁移能力,同时过表达miR-335时可抑制KDM3A的促癌功能;3.qPCR、western blot及CHIP-qPCR实验结果提示KDM3A通过结合在YAP1基因启动子区域促进YAP 1表达,同时过表达miR-335可以抑制KDM3 A对YAP 1基因的促进作用;通过CCK-8、transwell及划痕实验证明了过表达miR-335/KDM3A/YAP1信号轴对786-O细胞的增殖、侵袭和迁移能力的影响;4.m6A定量发现ccRCC的m6A水平明显降低,生信分析结合临床样本验证发现METTL14低表达,细胞功能实验表明低表达METTL14肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力增强;5.qPCR、WB、免疫荧光及核质分离实验发现敲低METTL14后,LATS1的RNA及蛋白水平降低,YAP1磷酸化降低,入核增加并启动下游癌基因表达;6.RNA 半衰期实验、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR 及 RNA-pulldown 实验发现YTHDF2可以识别METTL14对LATS1 mRNA的m6A修饰位点,并维持其LATS1 mRNA 稳定性;7.PDX模型发现临床样本经去m6A抑制剂处理后ki67的表达降低。结论1)miR-335在ccRCC中低表达,细胞实验证实低表达miR-335可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移能力;2)KDM3A是miR-335的靶基因,其通过结合于YAP1启动子区域促进YAP1转录进发挥促癌功能;3)METTL14在ccRCC中低表达,细胞实验证实低表达METTL14可以促进肿瘤细胞的增殖、迁移能力;4)YTHDF2可以识别METTL14对LATS1 mRNA的m6A修饰位点,并维持其LATS1 mRNA稳定性,促进蛋白水平升高,从而增强YAP1的入核启动癌基因表达;5)miR-335和METTL14通过不同表观遗传学途径调控Hippo信号通路进而影响ccRCC进展,miR-335-mimics和去m6A抑制剂是潜在的靶向治疗药物。