本文对腾冲嗜热厌氧杆菌Thermoanaerobacter tengcongensis MB4,嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius和硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfatariaus来源的嗜热糖化酶进行了基因扩增和原核表达初探。对Thermoanaerobacter tengcongensis MB4糖化酶进行了原核表达、纯化、酶学性质表征和定向进化方面的研究。论文取得的主要结果有:　　 (1)通过PCR扩增,获得了三个编码糖化酶的基因。对两个来源于古菌的糖化酶进行了表达初探。尝试了带有不同融合标签的表达载体pET28a、pET42b、pET48b,不同基因型的表达宿主BL21(DE3)、BL21-Gold(DE3)、BL21-Gold(DE3)plysS和BL21-CodenPlus(DE3)-RIPL；不同的诱导方式,IPTG或是自诱导；分子伴侣蛋白的共表达,都没有实现蛋白的活性表达。来源于T.tengcongensis MB4的糖化酶TtcGA在大肠杆菌中获得了活性表达。　　 (2)运用BLAS工程序在T.tengcongensis MB4基因组序列中搜索得到糖化酶基因Ttcga,基因全长2112 bp,编码703个氨基酸。对TtcGA进行氨基酸序列分析,结果表明其属于糖苷水解酶家族15,是一种典型的细菌糖化酶。TtcGA和来源于厌氧细菌Thermoanaerobacterium thermosaccharolytwum、Clostridium sp.G0005和Clostridiumthermoamylolyticum的糖化酶具有较高的相似性,相似度分别为72％,71％和70％。　　 (3)以T.thermosaccharolyticum糖化酶结构为模板,对TtcGA进行三维结构模拟。发现其具有细菌糖化酶常见的三个功能单位:β结构域、连接肽和α结构域。其中α结构域是其催化域,和真菌催化域具有类似的结构,提示他们具有相似的催化机理。　　 (4)运用PCR扩增得到Ttcga并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了可溶表达。重组蛋白TtcGA经热处理和分子筛两步纯化后达到电泳纯。该蛋白全长79 kD,信号肽分析N端存在21个氨基酸残基的信号序列,经信号肽酶处理后的成熟蛋白全长76.9 kD,活性状态为单体。以麦芽糖为底物,该糖化酶的最适反应温度为75℃,最适反应pH为5.0。TtcGA可以在75℃稳定6 h,是目前报道的最稳定的细菌糖化酶。以不同的α-葡聚糖为底物,发现TtcGA可以水解α-1,4和α-1,6糖苷键,但对α-1,4糖苷键的水解能力要强很多。该糖化酶对麦芽寡糖的水解能力要大于多糖,对麦芽糖的水解活力为175U/mg。动力学实验表明,TtcGA的最适底物为麦芽四糖。Ca2+,Mn2+,Co2+,Mg2+和还原剂DTT在检测浓度以下对TtcGA的活力没有影响,Zn2+,pb2+,Cu2+,和EDTA对其活力有抑制作用。　　 (5)优化了BL21(DE3)(pET42b-Ttcga)在96孔板中的培养条件,构建了热活力提高的突变体筛选方法。优化了筛选的培养时间,破壁条件,体系组成,反应时间等条件,使得整板的孔间差异小于12％,符合高通量筛选的要求。通过epPCR和:Megawhop法构建了TtcGA的随机突变文库,通过调节epPCR的Mn2+浓度,文库中约有50％的突变为致死突变。在此文库中共筛选了2000个克隆子,得到两个热稳定性提高的突变体I379T-N386D-A607V和I379V,分别使热活力提高了2.8和2.6倍。对前者的三个突变位点进行拆分,发现其中只有I379T对热活力提高有贡献,即379位点对TtcGA热活力比较重要。　　 (6)对379位点进行了饱和突变,发现了另外三个热活力提高的突变体,分别是I379A、I379C和I379R。对上述五个突变体进行热活力和热稳定性的表征,发现I379A、I379C和I379R使TtcGA的最适反应温度提高了5℃左右,而I379T和I379V对其没有影响:五个突变体使得TtcGA热活力提高2倍以上,T5015值比野生型提高了2-3℃。　　 (7)根据379位点在TtcGA三维结构中的位置,分析突变体影响热活力和热稳定性的可能因为。发现I379R可能是因为精氨酸的引入形成了新的氢键和离子键从而提高热稳定性,而其它四个突变体可能是因为减小了空间位阻效应,释放了较高的构象能量从而提高热稳定性。