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研究背景：超声造影(contrast-enhanced ultrasonography，CEUS)在对肝局灶性病变的诊断价值早已在世界范围内得到公认并广泛应用于临床[1-3]，其独特的血池显像特点保证了超声造影剂只在形成有效管腔的微血管里循环，这就为定量分析微血管分化程度提供一种可能，对研究肿瘤血流动力学及微循环具有极大价值。血管生成(angiogenesis)对于肿瘤发生、发展、转移、预后及抗肿瘤治疗方面都有较重要的影响[4，5]，一直是肿瘤研究的热点，然而对于肿瘤新生微血管分化程度，即有无形成稳定的血管结构，及有无有效血管腔方面的报道却很少见，特别对于肝癌的研究更少见。微血管密度(microvessel density，MVD)是评价肿瘤血管生成的金标准[6-8]，而微血管面积(microvessel area,MVA)[9-11]近年来也成为评价肿瘤血管生成的新方法。本研究旨在探讨超声造影灌注参数与肝癌微血管分化程度及微血管面积的关系。
目的：使用超声造影定量分析肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，探讨超声造影灌注参数与HCC微血管分化程度、微血管面积之间的相关性。
方法：选择在中山大学肿瘤医院行手术切除并经病理证实的肝细胞癌患者52例，术前行超声造影检查。入选病例均未经过放、化疗及手术治疗，基础显像满意。使用Sonoliver的超声造影定量分析软件对52例HCC的超声造影图像进行脱机分析，获得HCC病灶内及周围肝实质的的灌注曲线及相关参数：峰值强度(Maximum ofintensity，IMAX)，上升时间[Rise Time(from10％ to90％ of IMAX)，RT]，达峰时间(Time to peak，TTP)，平均通过时间(mean Trasit Time corresponding to thecenter of gravity，mTT)，上升斜率(Rise Slope，RS)，流出时间(Washout Time，WT)。微血管密度(Microvessel density，MVD)方法是定量分析肿瘤血管生成最常用的方法。不同血管标记物显示肿瘤微血管不同类型及不同特点，CD34在分化微血管内皮细胞中表达(CD34+)，而CD31在分化及未分化微血管内皮细胞中均表达(CD31+)[12，13]，因此定义未分化微血管为CD31阳性表达而CD34阴性表达的微血管(CD31+/CD34-)[14]；(SMA+)MVD代表成熟微血管数[15，16]。用血管内皮免疫染色标记物(CD31、CD34)及周细胞标记物(SMA)对连续组织切片分别染色。为排除微血管总数影响的偏倚，用分化及未分化微血管在全部微血管中所占比例来衡量微血管分化程度：即未分化微血管密度比[(CD31+/CD34-)MVD/CD31+MVD]、分化微血管密度比(CD34+MVD/CD31+MVD)及成熟微血管密度比(SMA+MVD/CD31+MVD)。应用Image Pro Plus6图像分析软件计算微血管面积(microvessel area,MVA)、微血管平均面积[17]。将所有病灶根据Edmondson病理分级[18，19]、微血管形态[20-22]分组，探讨超声造影灌注参数与微血管分化程度及微血管面积在各组内组间的关系。
结果：
⑴HCC中IMAX与分化微血管密度比呈正相关r=0.343，(Spearman相关检验,p＜0.05)。与未分化微血管密度比呈负相关r=-0.346，(Spearman相关检验,p＜0.05)。与CD34染色MVD呈正相关r=0.347，(Spearman相关检验,p＜0.05)。三组不同病理分级的HCC的WT有显著差异(Kruskal-Wallis Test，P＜0.05)，WT分别为33.41±8.31s(Ⅰ级)，16.47±3.92s(Ⅱ级)，12.17±5.34s(Ⅲ+Ⅳ级)，而IMAX、RT、TTP、mTT、RS、QOF的差异无明显统计学意义(Kruskal-WallisTest，P＞0.05)。三组不同微血管形态的HCC的IMAX、RT、TTP、mTT、RS、WT、QOF的差异无统计学意义(Kruskal-Wallis Test，P＞0.05)。HCC中灌注参数IMAX、RT、TTP、RS、WT与MVA、微血管平均面积无相关性(Spearman相关，P＞0.05)。
⑵根据Edmondson病理分级[18,19]将HCC分成三组：Ⅰ级11例，Ⅱ级22例，Ⅲ+Ⅳ级19例。CD31、CD34染色的MVD在各病理分级间分别为：Ⅰ级86.32±8.65、59.18±5.22，Ⅱ级65.38±5.48、46.78±2.69，Ⅲ+Ⅳ级57.79±5.36、42.17±4.15，二者在各病理分级问均存在显著差异(Kruskal-Wallis Test，p＜0.05)，即随着病理分级由高到低，MVD逐级减少。成熟微血管数(SMA+MVD)、未分化微血管密度比[(CD31+/CD34-)MVD/CD31+MVD]、分化微血管密度比(CD34+MVD/CD31+MVD)及成熟微血管密度比(SMA+MVD/CD31+MVD)在各病理分级间差异无统计学意义(Kruskal-Wallis Test，p＞0.05)。但随着病理分级由高到低，存在未分化微血管密度比减低，分化微血管密度比增加，成熟微血管密度增加的趋势。根据微血管形态[20-22]分成三组：点、线型13例，中间型26例，环状型13例；在各微血管形态分组间，CD31、CD34染色的MVD、成熟微血管数(SMA+MVD)存在显著差异(Kruskal-Wallis Test，p＜0.05)，其中在点、线型分别为76.34±6.10、56.66±4.33、28.62±2.55，中间型70.21±5.07、50.19±2.52、29.16±1.52，环状型51.22±6.20、33.85±4.74、19.10±2.36。即MVD在点、线型最多，环状型最少，而成熟微血管数在中间型最多，点、线型又多于环状型。未分化微血管密度比[(CD31+/CD34-)MVD/CD31+MVD]、分化微血管密度比(CD34+MVD/CD31+MVD)及成熟微血管密度比(SMA+MVD/CD31+MVD)在各微血管形态分组间差异无统计学意义(Kruskal-Wallis Test，p＞0.05)，但存在一定趋势：点、线型未分化微血管密度比最小，分化微血管密度比最大，环状型反之，成熟微血管密度比在中间型最大，环状型最小，点、线形居中。
⑶各病理分级间微血管平均面积差异有统计学意义(Kruskal-Wallis Test，p＜0.05)，而MVA差异无统计学意义。随着病理分级由高到低，微血管平均面积逐级递增。在各微血管形态分组间，MVA及微血管平均面积差异均有统计学意义(Kruskal-Wallis Test，p＜0.05)。MVA、微血管平均面积在点、线型最小，在环状型最大。
⑷CD31、CD34染色MVD及成熟微血管数(SMA+MVD)与微血管平均面积成负相关，r分别是-0.65、-0.44，-0.75，(Spearman相关，p＜0.05)，与MVA无相关性。未分化微血管数比[(CD31+/CD34-)MVD/CD31+MVD]与MVA呈正相关，r=0.29，(Spearman相关，p＜0.05)；分化微血管数比(CD34+MVD/CD31+MVD)与MVA呈负相关，r=-0.29，(Spearman相关，p＜0.05)。
结论：①超声造影灌注参数对于预测HCC微血管分化程度及病理分级有一定意义，但无法预测微血管形态及微血管面积：IMAX在一定程度上能反映微血管的分化程度，但无法反映微血管成熟性；IMAX与MVD呈正相关；WT与病理分级有关。②HCC微血管分化程度与病理分级、微血管形态无关，MVD与病理分级、微血管形态有关，成熟微血管数与微血管形态有关，与病理分级无关。③MVA能够预测HCC内微血管分化程度，并与微血管形态有关。微血管平均面积与病理分级、微血管形态有关，与MVD呈负相关。