论文部分内容阅读
颞下颌关节紊乱病(temporomandibular joint disorder, TMD)是口腔医学临床中常见病之一,尽管研究日益深入,但由于病因复杂,其发病机理尚未完全阐明。滑膜组织作为关节内重要组成部分,在TMD发生和发展中起着重要的作用。目前,已有大量体外培养实验研究证实从滑膜组织分离培养的滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts, SFs)区别于从非滑膜部位分离的成纤维细胞,具有独特的生物学特性。本课题以大鼠颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)双板区滑膜组织分离培养的SFs作为研究对象,分析SFs的润滑功能,成软骨分化及滑膜衬里重构的调控,以探讨SFs参与TMJ的适应性改建,维持关节内环境稳定的相关分子机制。第一部分大鼠滑膜细胞PRG4表达调控机制研究目的:蛋白多糖4(proteoglycan4, PRG4)是存在于关节滑液和软骨表面的大分子分泌糖蛋白,它在关节边界润滑体系中起主导作用,其表达在转录、蛋白合成、分泌等环节受应力和细胞因子的调控。本研究以原代培养的大鼠TMJ双板区的滑膜细胞为模型,观察相关细胞因子TGF-β1、TNF-α及应力负荷对滑膜细胞PRG4转录和合成分泌水平的影响,从生物力学角度初步探讨PRG4表达调控的分子机制。方法:取SD大鼠TMJ双板区平滑光亮的滑膜组织,采用组织块法分离培养滑膜细胞,并经免疫荧光细胞化学方法进行鉴定。利用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度TGF-β1、TNF-α及间歇静压力(intermittent hydrostatic pressure, IHP)作用下PRG4mRNA的表达;免疫荧光细胞化学、Elisa技术检测一定浓度的TGF-β1、TNF-α及IHP作用下PRG4蛋白的表达。Western blot和免疫荧光细胞化学技术分别检测Smad通路和P38MAPK通路相关蛋白在应力作用下表达,通过应用SB431542,观察阻断Smad通路对应力诱导PRG4表达的影响。结果:所有培养的滑膜细胞均对CD68蛋白表达阴性,vimentin蛋白表达阳性,并具有成纤维细胞的特点,是滑膜成纤维细胞(synovial fibroblasts, SFs). PRG4mRNA和蛋白表达水平随着TGF-β1浓度的增加和作用时间的延长而表达增多,呈现一定的剂量和时间依赖性;而不同浓度TNF-α对PRG4mRNA的表达均有抑制作用,其抑制效应呈剂量依赖性,且随着一定浓度TNF-α干预时间延长,PRG4蛋白表达呈现一定的时效性。研究结果发现IHP和TGF-β1之间存在协同刺激PRG4mRNA和蛋白表达作用,同时IHP在一定程度上抵消了TNF-α对PRG4表达的抑制作用。IHP作用使Smad2/3磷酸化水平的增加及Smad2/3蛋白核转位,但不能激活SFs内P38MAPK信号通路。应用SB431542阻断Smad通路能够抑制IHP促进PRG4表达的效应。结论:适当的应力负荷可协同增强TGF-β1对PRG4表达的正向调控作用,且能一定程度缓解炎症因子TNF-α对PRG4表达的抑制作用。Smad信号通路是参与应力刺激对PRG4表达调控的一条重要途径。第二部分TGF-β1通过RhoA/ROCK通路调控滑膜细胞软骨分化的初步研究目的:SFs属于间充质来源细胞,具有软骨化生能力,在关节损伤后的修复及适应性改建过程中起到重要作用。转化生长因子-β1(transfect growth factor-β1, TGF-β1)是关节软骨组织工程研究的首选生长因子,具有促进细胞增殖、细胞外基质的合成与分泌,调节骨及软骨组织的修复重建作用。本研究通过TGF-β1诱导大鼠SFs向软骨细胞分化,探讨RhoA/ROCK信号通路在TGF-β1诱导的SFs表型转化及软骨相关基因表达调控过程中的作用及意义。方法:由大鼠TMJ中分离培养SFs,在体外经TGF-β1诱导培养,采用RhoA活性测定及实时荧光定量PCR方法检测TGF-β1刺激前后细胞中RhoA/ROCK信号通路的改变。荧光显微镜观察SFs骨架蛋白F-actin的改变。实时荧光定量PCR技术研究TGF-β1诱导的SFs成软骨特征性基因(Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、aggrecan和Sox9)表达的影响。观察并比较加入特异性抑制剂hydroxyfasudil和Y27632阻断RhoA/ROCK通路对上述TGF-β1作用效应的影响。Western blot技术检测Y27632作用TGF-β1下游信号分子Smad2/3磷酸化水平的改变。结果:TGF-β1刺激SFs后,细胞中活化RhoA表达量和ROCK mRNA表达量明显增加,呈现时间依赖性趋势。TGF-β1的诱导对SFs细胞骨架F-actin具有重组作用,且该现象分别被RhoA/ROCK通路抑制剂hydroxyfasudil和Y27632特异性地阻断。Hydroxyfasudil和Y27632在不同程度上抑制了SFs经TGF-β1诱导分化后Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、aggrecan和Sox9mRNA表达。TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化表达被一定浓度的Y27632作用所抑制。结论:TGF-β1能够激活RhoA/ROCK信号通路并诱导F-actin骨架重组效应,抑制RhoA/ROCK信号通路后其对TGF-β1诱导的SFs软骨分化的抑制作用可能与其对TGF-β/Smad信号通路活性的下调相关。第三部分应力和TNF-α对滑膜细胞cadherin-11表达及调控机制研究目的:钙粘蛋白-11(cadherin-11)是一种滑膜组织特异性表达的钙粘蛋白,在滑膜形成、滑膜炎症和软骨破坏中发挥着重要的作用。本研究考察了体外培养的SFs在应力作用和炎症因子TNF-α刺激下,cadherin-11的分布、表达的改变,并进一步探讨PDK/Akt信号通路在其过程中发挥的调控作用。方法:由大鼠TMJ中分离培养SFs,免疫荧光细胞化学技术染色并观察正常SFscadherin-11蛋白分布情况;采用实时荧光定量PCR技术及Western blot检测不同大小应力和一定浓度TNF-α作用不同时间后cadherin-11mRNA与蛋白水平表达的变化。Western blot技术检测PI3K/Akt信号通路多种信号蛋白表达,观察应用特异性阻断剂LY294002阻断PI3K/Akt通路对cadherin-11mRNA与蛋白水平表达的影响。结果:荧光显微镜下观察cadherin-11蛋白位于相邻两SFs接触的边缘,与F-actin骨架连接紧密。持续HP作用12h能刺激cadherin-11mRNA与蛋白表达,并呈力值大小依赖关系。经lOng/ml TNF-α刺激后,cadherin-11mRNA与蛋白表达量随着TNF-α作用时间的延长而逐渐升高,呈一定的时间依赖关系。10ng/ml TNF-α和90kPa持续HP均能明显增强SFs内PI3K、Akt蛋白磷酸化水平。Akt磷酸化抑制剂LY294002能够明显降低SFs相应蛋白磷酸化水平。TNF-α和持续HP能够明显增强cadherin-11基因表达,并促进蛋白表达,该诱导激活作用可被LY294002阻断。结论:TNF-α和持续HP诱导SFs内cadherin-11的表达受PI3K/Akt通路的调控,特异性通路抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt通路可有效抑制上述作用。