【摘 要】
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几丁质广泛分布于动物、微生物体内,是自然界中含量仅次于纤维素的生物多聚物。其专一性水解酶——几丁质酶(chitinase)已成为当前研究的热点,它除了被用于植物病原真菌和害
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几丁质广泛分布于动物、微生物体内,是自然界中含量仅次于纤维素的生物多聚物。其专一性水解酶——几丁质酶(chitinase)已成为当前研究的热点,它除了被用于植物病原真菌和害虫的生物防治,还可以用作外敷药物治疗由真菌引起的人类疾病;可以制备酵母和丝状真菌的原生质体。分离几丁质酶基因、构建高效表达工程菌,对实现几丁质酶产业化具有重要意义。嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,能够在45℃～50℃的高温下很好的繁殖生长。本文以嗜热子囊菌光孢变种为材料,根据已获得的几丁质酶基因中间片段,通过RACE技术获得了嗜热子囊菌光孢变种的几丁质酶的全长基因Tachit,该基因已在GenBank中注册,登录号为EF608144。构建了原核表达载体pET22b(+)/Tachit并转化大肠杆菌E. coli BL21,经过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测,在约44kDa处有一条明显的蛋白带,可溶性分析结果显示,其表达产物主要以包涵体形式存在。另外分别构建了胞内表达载体pPIC3.5K/Tachit和酵母分泌型表达载体pPIC9K/Tachit并转化Pichia pastoris GS115,得到产几丁质酶的工程菌株。通过甲醇诱导,对酶液进行硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析获得了凝胶电泳均一的分子量约为45kDa几丁质酶。重组几丁质酶TACHIT的最适反应温度和pH分别为50℃和8.0,该酶在50℃以下稳定;在pH值为6～11之间重组几丁质酶保持稳定的酶活性。。
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