CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Tregs)是一类具有免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群。具有维持自身外周免疫耐受,防止自身免疫性疾病发生,以及抑制慢性炎症疾病的功能。目前,CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在肿瘤微环境、外周血、肿瘤局部引流淋巴结及肿瘤浸润淋巴结中均有发现,调节性T细胞在肿瘤的发生发展过程中,能够通过发挥免疫抑制功能和抑制抗肿瘤作用等机制削弱机体清除恶性细胞的能力,抑制机体对肿瘤细胞产生有效的免疫应答,在恶性病变的发生发展过程中发挥重要作用。　　 癌症是一类严重威胁人类健康的疾病。口腔癌(oral carcinoma)在全球范围内的发病率位于所有恶性肿瘤的第六位,其中以口腔鳞状细胞癌(oral squamous cellcarcinoma,OSCC)最为常见。早期防治一直是口腔鳞状细胞癌研究领域的热点。由于口腔黏膜癌变是一个多阶段、多基因改变的积累和相互作用的过程,因此明确口腔黏膜癌变的分子机制,阻断口腔黏膜癌前病变转化为鳞状细胞癌,是实现口腔鳞状细胞癌早期防治的关键。4-亚基硝氧喹啉(4-nitroquinoline-1-oxid,4NQO)诱导的大鼠舌黏膜癌变模型,其组织病理学变化和分子机制与人类的口腔鳞状细胞癌相似,能较为真实的反映人舌鳞状细胞癌的发生发展过程中的变化,有利于动态的观察口腔黏膜癌变过程,是最常用的研究口腔癌的动物模型。因此本实验应用4NQO诱发大鼠舌癌的动物模型,动态观察大鼠舌黏膜癌变过程中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在实验动物外周血和肿瘤局部引流淋巴结中的表达变化,以及Foxp3,TGF-β在舌部病变组织中的转录水平,探讨CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在口腔黏膜癌变中的作用。　　 第一章4NQO诱发大鼠舌黏膜癌变模型的建立　　 目的：　　 应用25ppm4NQO饮水法建立SD大鼠舌黏膜癌变动物模型,用于下一步的实验研究。　　 方法：　　 60只雌性SPF级大鼠随机抽取20只作为对照组正常喂养,其余40只作为实验组,以25 ppm的4NQO饮水喂养。饮用水避光保存。在实验的第16和24周用10％的水合氯醛腹腔麻醉大鼠,随机处死实验组和对照组大鼠。实验组切取舌部病变组织,正常对照组直接切取相对应的舌黏膜组织,纵行切开分为两份,一份组织固定于4％的多聚甲醛,24h后进行石蜡包埋,切片后进行HE染色,然后进行组织病理学分析。另一份组织液氮保存备用。　　 结果：　　 实验结束时共获得组织标本50个,经病理检查分为以下五组:正常对照标本17个、轻度异常增生标本1个、中度异常增生标本8个、重度异常增生标本12个、鳞癌标本12个。　　 第二章大鼠舌黏膜癌变过程中外周血及颈淋巴结中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的表达研究　　 目的：　　 评估在大鼠舌黏膜癌变过程中正常对照组,中度异常增生组,重度异常增生组以及鳞癌组大鼠外周血以及肿瘤局部引流淋巴结中CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的表达情况。　　 方法：　　 实验动物分为四组:正常对照组大鼠9只,中度异常增生大鼠8只,重度异常增生大鼠7只,鳞癌大鼠9只。应用流式细胞仪对各组大鼠外周血中以及局部引流淋巴结中的CD4+T细胞以及CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的分布情况进行检测。并以CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+T细胞数量的百分比来评估调节性T细胞的表达情况。　　 结果：　　 大鼠外周血中,正常对照组的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为1.40±0.31％,中度异常增生组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为1.94±0.72％,重度异常增生组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为2.29±0.82％,鳞癌组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为3.82±0.62％。与正常对照组相比,鳞癌组和重度异常增生组外周血中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞百分比升高,差异具有显著性(与正常组比较,鳞癌组P<0.001,重度异常增生组P=0.009),中度异常增生组外周血中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞百分比升高不显著,差异不具有统计学意义(P=0.092)。重度异常增生组与中度异常增生组外周血中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞百分比差异不显著,不具有统计学意义(P=0.291)。　　 大鼠颈部引流淋巴结中,正常对照组的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为5.53±2.07％,中度异常增生组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为8.93±1.74％,重度异常增生组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为10.15±0.86％,鳞癌组CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞的比例为14.67±3.09％。与正常对照组相比,鳞癌组、重度异常增生组和中度异常增生组颈部引流淋巴结中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞百分比升高,差异具有显著性(与正常组比较,鳞癌组P<0.001,重度异常增生组P<0.001,中度异常增生组P=0.002)。重度异常增生组与中度异常增生组颈部引流淋巴结中的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞占CD4+细胞百分比差异不显著,无统计学意义(P=0.279)。　　 第三章大鼠舌黏膜癌变组织中Foxp3和TGF-β转录水平的研究　　 目的：　　 观察叉头状转录因子(forkhead box P3 transcription factor,Foxp3)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)转录水平在4NQO诱发大鼠舌黏膜癌变过程中的动态变化,探讨其在实验性大鼠舌黏膜癌变中的作用,以及两者转录水平之间的相关性分析。　　 方法：　　 利用第一章实验中所获得大鼠舌部目的组织,实验分为3组:正常对照组,癌前病变组(异常增生组),以及舌鳞状细胞癌组,每组8例样本,提取总RNA,应用实时荧光定量PCR技术检测个样本中Foxp3和 TGF-β的转录水平,并对其结果进行分析和统计。　　 结果：　　 1.完整性和纯度鉴定结果　　 (1)纯度检测:OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染,可以用于后续实验。　　 (2)总RNA完整性检测:用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整,证明总RNA抽提比较完整,可以用于后续实验。　　 2.Foxp3在大鼠舌黏膜正常组织,癌前病变组织及鳞状细胞癌组织中的转录水平　　 在正常对照组织中Foxp3 mRNA的相对表达量为1.78±0.76,癌前病变组织中Foxp3 mRNA的相对表达量为3.58±1.00,鳞状细胞癌组织中Foxp3 mRNA的相对表达量为6.06±2.54。与正常对照组相比较,鳞状细胞癌组和癌前病变组的Foxp3 mRNA的相对表达量显著上升,差异具有统计学意义(鳞状细胞癌组P=0.005,癌前病变组P=0.004)。癌前病变组与鳞状细胞癌组相比较,鳞状细胞癌组织中的Foxp3 mRNA的相对表达量与癌前病变组中Foxp3 mRNA的相对表达量无显著差异(P=0.081)。　　 3.TGF-β在大鼠舌黏膜正常组织,癌前病变组织及鳞状细胞癌组织中的转录水平　　 在正常对照组织中TGF-β mRNA的相对表达量为2.99±1.60,癌前病变组织中TGF-β mRNA的相对表达量为5.16±1.55,鳞状细胞癌组织中 TGF-β mRNA的相对表达量为13.63±3.04。与正常对照组相比较,鳞状细胞癌组相对表达量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。癌前病变组与鳞状细胞癌组相比较,鳞状细胞癌组织中的 TGF-β mRNA的相对表达量比癌前病变组中TGF-β mRNA的相对表达量显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。癌前病变组与正常对照组相比较,癌前病变组织中相对表达量显著差异,差异有统计学意义(P=0.043)。　　 4.大鼠舌黏膜正常组织,癌前病变组织和鳞状细胞癌组织中Foxp3和TGF-βmRNA相对表达量的之间的相关分析　　 对大鼠舌部组织中不同病理阶段的Foxp3和TGF-β mRNA相对表达量间关系进行Spearman相关分析,结果显示Foxp3和TGF-β mRNA相对表达量之间呈正相关关系,相关关系显著(相关系数r=0.686,P<0.001)。　　 全文结论：　　 1.4NQO诱发大鼠舌黏膜癌变过程中,CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在鳞癌组的外周血及肿瘤局部引流淋巴结中的水平比中重度异常增生和正常对照组明显升高。这提示,CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞的增多可能是口腔鳞癌发生发展过程中的早期事件,大量的CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞促进舌鳞状细胞癌的发生发展。　　 2.在大鼠舌黏膜癌变过程中,舌部病变组织中的Foxp3和TGF-β基因转录水平在鳞癌组中明显升高,两者之间具有显著的正相关关系。提示Foxp3和TGF-β基因的异常参与口腔黏膜癌变过程。