论文部分内容阅读
背景与目的:近年来,微小RNA(micro RNA,miRNA)的发现为现代肿瘤的治疗提供了一个新的视角,其中就包括我们所探讨的胶质瘤。微小RNA是一种小分子非编码RNA,其可以通过结合于靶向基因的3’非转录区(3’-untranslated region,3’-UTR)来调节相关蛋白的表达。随着对miRNA的研究的深入,虽然有很多miRNA逐渐被人们所熟知,但其仅仅是miRNA家族的一小部分,需要更多的研究来更深入的认识其功能及作用。miRNA并不能直接引起细胞功能的改变,其主要是通过调控下游靶基因尤其是一些转录因子的表达而调节细胞功能的。E2F转录因子家族一开始是因为其可以与腺病毒E2启动子区结合从而引起相关基因转录而被发现的。随后的研究表明,在哺乳动物中,E2F家族与细胞周期的调节密切相关。然而近年来,越来越多的研究集中于这个转录因子家族与各种癌症的发生发展的关系上,而且研究也表明,其可能在癌症的发生发展中起着不可小觑的作用。本研究通过体外实验及临床数据分析,发现由miR-218介导的E2F2基因的调节在抑制胶质瘤发生发展中发挥重要作用。此发现可能为今后的胶质瘤诊断,治疗,及判断患者预后方面提供一个新的方向和思路。研究方法:1、利用下载于中国胶质瘤基因组图谱数据库(Chinese Glioma Genome Atlas,CGGA)的人胶质瘤和正常脑组织的miRNA、m RNA的芯片表达数据以及患者的生存数据进行相关数据分析。2、利用miRNA荧光定量PCR技术检测miR-218在胶质瘤组织及细胞中的表达水平,及转染miR-218 mimic后验证miR-218的表达水平变化情况。3、利用E2F2-si RNA敲低E2F2表达,或转染miR-218 mimic后利用western-blot技术检测E2F2表达变化情况。4、利用流式细胞仪检测不同组别胶质瘤细胞周期变化情况。5、同时利用CCK8实验及平板克隆形成实验,检测细胞生长增殖能力的改变情况。6、使用Biovision公司糖代谢检测试剂盒,检测不同组别胶质瘤细胞糖代谢的情况变化。7、采用生物信息预测、荧光素酶报告实验和Western-blot技术验证E2F2为miR-218直接靶基因。研究结果1、CGGA数据库分析得出miR-218在胶质瘤中表达明显降低,且其在胶质母细胞瘤中表达水平与患者预后成正相关。2、体外实验中,胶质瘤细胞系U87及U251中升高miR-218的表达后,细胞周期明显阻滞于G1期,细胞增殖速率明显减慢,葡萄糖消耗量及乳酸生成量减少。3、根据CGGA数据库数据分析结果表明,E2F2基因在胶质瘤中呈高表达,且生存分析表明其高表达提示患者预后不良。4、在体外实验中,转染E2F2 si-RNA后,E2F2表达明显下降,且细胞周期明显阻滞于G1期,细胞增殖速率明显减慢,糖代谢检测提示葡萄糖消耗量及乳酸生成量明显减少。5、生物信息学预测、荧光素酶报告基因检测和Western-blot实验研究表明:miR-218直接结合E2F2 m RNA的3’UTR区,调控其的表达。6、利用E2F2回复实验表明,上调E2F2后能够逆转miR-218产生的抑癌效应,使得细胞增殖能力及糖代谢水平有所逆转。研究结论1、E2F2在胶质瘤中的表达较正常组织中明显升高,其表达量越高,患者生存时间越短。2、miR-218在胶质瘤中表达明显较正常组织中低,其表达情况与E2F2成负相关,且其在胶质母细胞瘤患者中的表达越高,患者生存期越长。3、miR-218通过直接靶向调节E2F2来影响胶质瘤细胞的增殖及糖代谢水平,可能为今后及早诊断及治疗胶质瘤提供一个新的靶点。